收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

融合肽minTBP-1-PRGDN涂层影响钛表面成骨细胞粘附、增殖及分化功能的体外研究

王丹  
【摘要】:金属钛因其良好的耐腐蚀性、生物相容性和骨整合性,在临床上已广泛用作于牙科修复种植体、正畸支抗种植体或人工关节。钛种植体稳定性是其植入成功的关键,多种活性肽和蛋白已被用于修饰钛种植体表面,以促进骨与种植体之间的达到稳定的骨性整合。RGD (Arg-Gly-Asp)肽作为大部分细胞外基质蛋白(包括一些矿化相关蛋白)的共有序列,是目前最有效和应用广泛和的促进生物材料表面细胞粘附的肽,而如何将肽固定于生物材料的表面是提高细胞粘附的前提。学者们试图借助于羟基、氨基或羧基等功能基团,将RGD通过共价结合的方式固定在生物材料的表面。然而,这些偶联方式存在一些缺点:除了复杂的处理过程外,偶联剂的毒性或者活性基团因水解而失活等现象均不容忽视。TBP-1 (RKLPDAPGMHTW)是一种新的从12肽噬菌体库中分离出来的肽适体,其具有与金属钛特异性相互作用的能力,其N端的RKLPDA (minTBP-1)序列是钛结合的重要位点。鉴于其对钛强大的特异性识别能力,minTBP-1常以与其他基序相结合形成融合肽,使得这些融合肽被赋予了同样的对钛特异性识别的能力。鉴于此,本研究合成一种含有RGD和minTBP-1序列的融合—RKLPDAPRGDN,探讨其与钛表面的相互作用;以及用该融合肽作为钛表面涂层,探讨对成骨细胞附着、伸展、增殖、分化及矿化功能方面的影响。 第一部分融合肽minTBP-1-PRGDN与钛表面相互作用的研究 目的探讨融合肽minTBP-1-PRGDN、minTBP-1及PRGDN在不同浓度时对钛亲和性的影响;氧化和未氧化钛表面对三种肽结合能力的影响;FITC标记对肽结合能力影响。 方法实验一:钛片经顺序打磨、清洗、消毒备用,三种肽以不同浓度(1μg/ml,10μg/ml, 100μg/ml, 1000μg/ml)孵育钛片过夜,双蒸水洗去未结合的肽。实验二:钛片经顺序打磨、清洗、一部分经30%硝酸氧化(另一部分不氧化)、消毒备用,XPS检测氧化与未氧化钛片表面元素成分;三种肽以100μg/ml浓度分别孵育氧化和未氧化的钛片过夜,双蒸水洗去未结合的肽。实验三:钛片经顺序打磨、清洗、氧化、消毒备用,三种肽以100μg/ml浓度按照未标记与标记比例为0:1(None)、10:1、100:1分别孵育钛片过夜,双蒸水洗去未结合的肽。荧光显微镜拍照,IPP图像分析软件采集荧光照片的像素点、以平均每个钛片上的荧光像素点的数量作为结合到钛片表面的肽数量的间接反映。 结果实验一:三种肽随着浓度的增加其结合到钛片上的数量均逐渐增加,100μg/ml时各种肽在钛片的结合接近饱和。实验二:经氧化后的钛片表面氧元素含量增加;minTBP-1-PRGDN和minTBP-1在氧化的钛片表面的结合数量增加,而PRGDN肽数昊减少。实验三:随着未标记肽掺入到标记肽中的比例增加,钛片表面荧光数量减少。 第二部分融合肽minTBP-1-PRGDN对成骨细胞粘附的影响 目的探讨不同肽涂层的钛表面对成骨细胞附着数量、伸展形态及面积、粘附相关基因表达的影响。 方法钛片经顺序打磨、清洗、氧化、消毒备用,三种肽以100μg/ml浓度孵育钛片表面过夜,未有肽孵育组作为空白对照;PBS洗去未结合的肽;成骨细胞在钛片表面生长一定时间后(实验四、五为1h,实验六为24h),PBS洗去未粘附细胞。实验四:Alamar Blue比色法检测附着细胞的数量;实验五:FITC-鬼笔环肽染色粘附细胞,荧光显微镜照相,IPP软件分析细胞伸展面积;实验六:RT-PCR荧光定量检测Integrinβ1和Cadherin-11基因表达。 结果实验四:minTBP-1-PRGDN涂层钛片上附着的成骨细胞数量最多、PRGDN涂层组的细胞数量最少:实验五:minTBP-1-PRGDN融合肽涂层的钛片表面的成骨细胞伸展充分、面积最大,但细胞伪足少;PRGDN涂层的钛片表面成骨细胞伸展最不充分,多接近于立方形,伸展面积与其他各组相比也是最小;实验六:Integrinβ1和Cadherin-11基因表达量在PRGDN组均为最高。 第三部分融合肽minTBP-1-PRGDN对成骨细胞增殖的影响 目的探讨不同肽涂层的钛表面对成骨细胞增殖数量、形态及相关基因表达的影响。 方法实验七:MTT比色法检测四组成骨细胞在24h、48h、72h时的增殖数量;细胞经Giemsa's染色后金相显微镜观察在增殖72h时的形态;实验八:RT-PCR荧光定量检测Collagen la 1和Cyclin D1基因表达。 结果实验七:各组细胞随时间延长数量逐渐增加,24h时minTBP-1-PRGDN涂层钛片表面的成骨细胞数量最多;72h时各组细胞大部分呈长梭形,伸展充分,并沿着钛片表面打磨的痕迹方向排列;实验八:cyclin D1:对照组外,其余各组表达量随时间延长而增加;达到72h时,minTBP-1-PRGDN组的cyclin D1表达量最大。CollagenⅠα1:各组表达量随时间延长降低后又有所增高;24 h时,PRGDN组的表达量最高;48h时,空白对照组表达量最低;72h时,minTBP-1组表达量最高。 第四部分融合肽minTBP-1-PRGDN对成骨细胞分化及功能的影响 目的探讨不同肽涂层的钛表面对成骨细胞分化过程中ALP酶活性、矿化相关基因表达、矿化结节形成数量及面积大小的影响。 方法实验九:PNPP法检测成骨细胞诱导分化第3,7,10,14,21,28d时的ALP酶活性;实验十:RT-PCR荧光定量检测ALP、OPN、BSP、OC基因表达;实验十一:细胞诱导矿化28d后,茜素红染色矿化结节,金相显微镜照相,IPP软件分析各组结节数量及平均面积。 结果实验九:各组成骨细胞诱导3-10d内,ALP活性值缓慢递增,从14d开始,ALP量的增加开始加速,28d时达到峰值;实验十:minTBP-1-PRGDN涂层表面成骨细胞分泌的OPN、OC、BSP及ALP四种基因的表达趋势均为:随着时间的延长,表达量先上升后降低,且在第14天时达到高峰。而minTBP-1涂层表面成骨细胞分泌的这四种基因的表达趋势均为随着时间的延长,表达量逐渐上升。空白对照组中,除了OC表达先降低后增高以外,其余三种基因的表达均为逐渐升高。而PRGDN组中除了BSP的表达先增加后减少外,其他三种基因的表达均为先降低升高。四种基因在第7d时,PRGDN组的表达均为最高;第14d时minTBP-1-PRGDN组表达量最高;实验十一:minTBP-1-PRGDN组的结节面积最大而minTBP-1组的平均面积最小;结节数量在PRGDN组最多而minTBP-1组最少。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李星;陈俊英;黄楠;;钛阳极氧化制备TiO_2-PTFE复合氧化膜及其微观特征[J];功能材料;2007年12期
2 陈建治;张富强;石玉龙;王磊;闫凤英;;纯钛表面微弧氧化法制备含羟基磷灰石氧化膜的实验研究[J];生物医学工程学杂志;2008年01期
3 陶凤娟;余优成;陈万涛;;钛金属表面纳米化技术及纳米化后生物学特性变化的研究进展[J];中国口腔颌面外科杂志;2008年06期
4 杨晓喻;刘长虹;梁星;孙俊;;不同钛表面对大鼠成骨细胞功能和细胞周期的影响[J];中国口腔种植学杂志;2009年02期
5 高淑春;翟玉春;胡金玲;;纯钛表面阳极氧化膜的制备及其生物活性研究[J];中国医疗器械杂志;2010年05期
6 舒成军;骆小平;邬烈;;表面处理对两种钛瓷粉的钛瓷结合力的影响[J];口腔医学研究;2007年05期
7 吴尧;虞奇峰;唐敏;杨帮成;李虎;张兴栋;;阳极氧化活化处理纯钛经皮种植体的体内外实验研究[J];生物医学工程学杂志;2006年01期
8 孙桂兰;王磊;;纯钛表面微弧氧化膜在模拟体液中的腐蚀行为[J];上海口腔医学;2007年03期
9 饶桦强;冯波;鲁雄;汪建新;江旭;翁杰;;钛表面固定纤维连接蛋白及其体外细胞培养[J];复合材料学报;2008年06期
10 刘长虹;杨晓喻;梁星;孙俊;;不同钛表面对人牙周膜细胞功能和细胞周期的影响[J];中国口腔种植学杂志;2009年02期
11 廖玉珍;杨苹;王进;黄楠;;内皮细胞在钛金属表面透明质酸微图形上的粘附行为[J];功能材料;2010年10期
12 成炜;陈吉华;马楚凡;郭恒;杜方翀;;纯钛种植体表面不同化学组成微弧氧化膜的结构与成分分析[J];中国美容医学;2007年01期
13 刘慧颖;王学金;伊哲;王浪平;王小峰;艾红军;;氟离子注入钛表面改性对成骨细胞黏着斑形成的影响[J];华西口腔医学杂志;2008年02期
14 李冬梅;郭天文;马楚凡;王宝成;;不同喷砂粒度的预处理对钛与不同瓷聚合体粘接强度的影响[J];实用口腔医学杂志;2008年03期
15 刘慧颖;刘洋;王浪平;王小峰;马国武;;氟离子注入钛表面改性材料的骨细胞相容性和抗菌性能[J];中国口腔种植学杂志;2009年02期
16 赵静辉;周延民;刘玉艳;高东辉;李春艳;;纯钛表面氨基化改性对细胞生长的影响[J];口腔医学研究;2010年01期
17 吕武龙;张振庭;任卫红;堵国君;刘宏;王跃;;不同厚度溶胶-凝胶法二氧化硅薄膜对钛瓷结合强度的影响[J];口腔颌面修复学杂志;2010年03期
18 朱娴;章燕珍;;氟及白蛋白对钛合金抗腐蚀性能影响的研究现状[J];口腔材料器械杂志;2010年04期
19 战德松,赵宝红,田维明,崔福斋;RGD修饰纯钛表面对人牙龈成纤维细胞生物学行为的影响[J];材料研究学报;2005年03期
20 陈佳龙;李全利;陈俊英;黄楠;;利用胶原-肝素自组装多层膜改善纯钛表面血液相容性的研究[J];功能材料;2008年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨家华;王少安;邓天燕;;细菌污染钛表面对人体单核细胞激活和分泌的影响[A];第四届全国口腔种植学术会议论文集[C];2005年
2 李争显;周廉;徐重;周慧;陆京;陈大民;张树林;;钛表面等离子冶金技术的研究[A];2004’全国真空冶金与表面工程学术研讨会会议论文集[C];2004年
3 何福明;赵姗姗;刘丽;陈松;王小祥;;纯钛表面快速仿生制备钙磷涂层的研究[A];第四届全国口腔种植学术会议论文集[C];2005年
4 张玉梅;张若冰;刘亚京;;钛表面微弧氧化处理后烧结参数对钛瓷结合强度影响的研究[A];第六次全国口腔修复学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
5 李文慧;鲜苏琴;;流体切应力下不同钛表面形貌对成骨细胞的影响[A];第六次全国口腔修复学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
6 孟惠民;石锗元;俞宏英;王旭东;李辉勤;樊自拴;松永守央;孙冬柏;;抗有机物劣化的贵金属氧化物涂层电极的开发[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
7 邓天燕;王达刚;杨家华;王少安;;钛表面形貌对人单核细胞生物学行为影响的实验研究[A];口腔新材料的临床应用技术研讨会论文集[C];2005年
8 杨大颐;齐民;张静莹;许洋;;锌含量对钛表面钙磷涂层结构的影响[A];第七届中国功能材料及其应用学术会议论文集(第2分册)[C];2010年
9 刘文科;曹小华;彭述明;;氧化层对钛吸附和解吸氘动力学影响[A];中国工程物理研究院科技年报(2003)[C];2003年
10 刘慧颖;刘洋;王浪平;王小峰;马国武;;氟离子注入钛表面改性材料的骨细胞相容性和抗菌性能[A];第六届全国口腔种植学术会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王丹;融合肽minTBP-1-PRGDN涂层影响钛表面成骨细胞粘附、增殖及分化功能的体外研究[D];华中科技大学;2010年
2 江巧红;多孔纯钛种植体表面BMP-2基因薄层的组装、性能和生物学评价[D];浙江大学;2012年
3 刘飞;钛合金关节假体采用氨气等离子注入法表面改性对成骨细胞生物活性影响的实验研究[D];苏州大学;2012年
4 黄怡;大鼠牙髓干细胞在微弧氧化钛表面诱导分化成骨的研究[D];华中科技大学;2012年
5 刘慧颖;氟离子注入钛表面对骨细胞相容性和抗菌性能的影响[D];中国医科大学;2008年
6 李晋波;医用钛表面改性及其抗菌性和生物活性研究[D];湖南大学;2012年
7 胡江;激光快速成形制备钛表面HA涂层及其成骨相关性能研究[D];第四军医大学;2011年
8 杨晓喻;成骨细胞和牙周膜细胞在不同钛种植体表面附着与矿化的机理研究[D];四川大学;2004年
9 杨晓峰;钛表面改性及其生物活性的研究[D];浙江大学;2008年
10 杨帆;钛表面含辛伐他汀药物涂层的制备及其对骨质疏松症大鼠种植体骨结合作用的研究[D];浙江大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 么远;纯钛表面不同处理对成骨细胞生长的影响[D];河北医科大学;2011年
2 赵元龙;钛表面不同处理技术对钙盐沉积的影响[D];吉林大学;2013年
3 刘潇;纯钛表面不同处理对人牙龈成纤维细胞增殖的影响[D];河北医科大学;2011年
4 丁思阳;纯钛表面电化学氧化处理对牙周膜干细胞和成骨细胞功能的影响[D];南京医科大学;2012年
5 乔磊;四种钛表面对成骨细胞生长的影响[D];昆明医学院;2010年
6 张扬;纯钛表面不同处理对骨髓间充质干细胞矿化的影响[D];河北医科大学;2011年
7 范利梅;自分泌胞外全基质修饰钛种植体表面的研究[D];安徽医科大学;2010年
8 王亚敏;不同粗化喷砂—酸蚀纯钛表面的性能研究[D];南方医科大学;2011年
9 王雅洁;纯钛表面不同化学处理影响钛—瓷结合强度的研究[D];山西医科大学;2012年
10 陈静;纯钛表面粗糙度对人牙龈成纤维细胞影响的体外实验研究[D];四川大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 安徽省安庆市食品药品监督管理局 李怡和;加强医疗器械钛材料监管[N];中国医药报;2007年
2 钟爱民;钛革命即将到来[N];中国矿业报;2002年
3 潘廷祥;探索金属钛的生命之旅[N];中国有色金属报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978