收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

癌基因DJ-1在人肝细胞癌中的作用及其机制研究

刘顺芳  
【摘要】:第一部分DJ-1在肝细胞癌中的表达及其预后价值 目的:DJ-1作为新近发现的癌基因参与多种恶性肿瘤的发病机制。本研究旨在探讨DJ-1在人肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)临床病理组织标本中的表达,及其与HCC临床病理变量和生存预后的关联性。 方法:收集149例未经治疗的HCC组织标本,所有标本均具备完整的临床病理及随访预后资料。采用逆转录聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)、免疫组织化学染色和Western Blot方法,检测DJ-1在HCC中的表达,统计分析DJ-1的表达与临床病理变量及生存预后的关联性。 结果:与对应的癌旁组织、肝硬化组织和正常肝脏组织比较,DJ-1在HCC组织中显著高表达;Pearson卡方检验分析表明,DJ-1表达与术前AFP水平、肝硬化程度、门静脉侵犯与否、分化程度和Edmondson分期等临床病理变量密切相关;DJ-1高表达组患者的无瘤生存时间和总体生存时间明显短于DJ-1低表达组;多因素Cox比例风险模型分析显示,DJ-1为判断HCC患者总体生存时间的独立预后因素(HR,2.568;P=0.003);相关性分析表明,HCC组织中DJ-1与抑癌基因PTEN表达显著性负相关(r=-0.836,P0.001)。 结论:DJ-1在HCC组织标本中高表达。DJ-1的表达水平与HCC临床病理资料及患者预后相关,说明DJ-1在HCC的发生、发展中起到重要作用。 第二部分DJ-1在人肝癌细胞株的表达及其shRNA稳定转染HepG2细胞系的建立 目的:检测DJ-1在人肝癌细胞株的表达,构建针对DJ-1的小发夹RNA (small hairpin RNA, shRNA)真核表达载体,获取干扰DJ-1表达的质粒,转染人肝癌HepG2细胞,稳筛后挑选亚克隆细胞系。 方法:在不同的人肝癌细胞株中,应用Western Blot及免疫细胞化学法检测DJ-1的表达水平及细胞定位;设计干扰DJ-1表达的shRNA序列结构,构建RNA干扰(RNA interference, RNAi)真核表达载体pGenesil-1.1质粒,经过酶切、测序鉴定;干扰质粒经脂质体介导转染人肝癌细胞HepG2,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;利用半定量RT-PCR及Western Blot分别检测筛选亚克隆细胞系的mRNA和蛋白表达。 结果:DJ-1在人肝癌细胞株:HepG2、MHCC-97L、MHCC-97H、SMMC-7721及Huh-7中高表达,且不同肝癌细胞株中DJ-1表达存在差异(P0.05),但在对照组人胚胎肝细胞L02中表达缺失。激光共聚焦显示,DJ-1表达主要定位于肝癌细胞胞质;合成并构建DJ-1 shRNA质粒载体,双酶切后电泳测序证实DJ-1干扰序列及读码框完全正确;成功筛选稳定转染干扰质粒的HepG2亚克隆细胞系,荧光显微镜下呈现绿色荧光,半定量RT-PCR检测显示干扰质粒明显抑制DJ-1 mRNA表达,Western Blot检测DJ-1蛋白抑制率为98.78%(P0.05)。 结论:DJ-1在人肝癌细胞株胞质高表达,且其表达程度与肝癌细胞恶性生物学特性相关;成功构建DJ-1 shRNA真核表达载体,建立干扰质粒稳定转染HepG2细胞系亚细胞克隆,为以DJ-1基因为靶点的人肝癌基因治疗的理论研究提供实验基础。 第三部分shRNA抑制DJ-1表达在人肝癌细胞HepG2中调控Akt/NF-kappaB信号通路 目的:研究癌基因DJ-1在人肝癌细胞株HepG2中对Akt/NF-KB信号通路的调控作用。 方法:应用Western Blot方法在不同的人HCC细胞株,HepG2、SMMC-7721、Huh-7、Hep3B、MHCC-97L和MHCC-97H中检测癌基因DJ-1和抑癌基因PTEN的表达。采用基因沉默shRNA技术,在人HCC细胞HepG2中特异性稳定抑制DJ-1表达。离体及在体观察,DJ-1潜在作用靶点:Akt和磷酸化Akt、核因子κB (nuclear factor kappaB, NF-κB)及其抑制因子(inhibitor of NF-κB, IκB)的表达差异性。流式细胞检测法研究细胞周期转换、MTT比色法判断细胞增殖能力、黏附侵袭实验观察细胞黏附转移能力;建立HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤模型,评估DJ-1对成瘤能力的影响。 结果:DJ-1在不同转移潜能的人肝癌细胞株:HepG2、SMMC-7721、Huh-7、Hep3B、MHCC-97L和MHCC-97H中高表达,且不同肝癌细胞株中DJ-1表达存在差异(P0.05); PTEN在人肝癌细胞株中低表达;成功构建DJ-1 shRNA真核表达载体,建立干扰质粒稳定转染HepG2细胞系亚细胞克隆;与对照组及HepG2组相比,干扰DJ-1表达组在裸鼠皮下种植瘤模型中肿瘤生长缓慢(P0.05);在HepG2细胞及裸鼠动物模型组织标本中,干扰DJ-1表达上调PTEN表达水平、抑制Akt磷酸化及NF-κB的激活;在HepG2细胞中干扰DJ-1表达,抑制细胞分化增殖、降低细胞黏附侵袭、阻滞细胞G1/S周期转换。 结论:shRNA介导的RNAi干扰DJ-1的表达,抑制Akt磷酸化及NF-κB激活入核,上调PTEN表达水平;干扰DJ-1表达能够抑制HepG2细胞增殖、黏附及侵袭能力。DJ-1参与对Akt/NF-KB信号通路的调控,在HCC的肿瘤发生机制中发挥着重要作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 钱海鑫!215006,刘俊卯!215006;桂皮酸体外诱导人肝癌细胞分化[J];江苏医药;2001年01期
2 魏玲;王兴武;宋现让;左文述;;As_2O_3诱导人肝癌细胞凋亡及对Fas表达和钙含量的影响[J];中国药理学通报;2005年11期
3 薛新波;郑建伟;王从俊;陈堃;胡回忆;胡慧;于愿;吴在德;;腺病毒介导MDA-7/IL-24选择性促进肝癌细胞的凋亡和增殖阻滞[J];中华肝脏病杂志;2006年09期
4 王晨宇;刘连新;王嘉倍;;维生素K_3对肝癌细胞株的生长抑制作用及其与三氧化二砷的联合效果[J];哈尔滨医科大学学报;2010年03期
5 李小颖;高凯;董伟;张连峰;;荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较[J];中国比较医学杂志;2011年03期
6 张明满,苟兴华,李德华,严律南,夏冬,韩蕾,苏芝,赵兰英,胡海洋;重组腺病毒介导反义2型基质金属蛋白酶抑制人肝癌细胞株浸润的实验研究[J];中华肝脏病杂志;2005年04期
7 薛国柱,窦科峰,赵爱志,药立波;全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析[J];临床肝胆病杂志;2005年04期
8 王宁;李玉;刘洁;;辐射对肝癌细胞HepG2多药耐药基因MDR1表达影响的实验研究[J];中国实验诊断学;2006年01期
9 黄少萍;杨宁;刘艳;花菊兰;;MnCl_2对树突状细胞调节T细胞抗肿瘤活性的实验研究[J];东南大学学报(医学版);2006年03期
10 阿不都热依木·玉苏甫;哈木拉提·吾甫尔;吐尔洪·卡迪尔;Isabelle Baudrimont;Nicholas Moore;;异常黑胆质成熟剂乙酸乙酯萃取物对HepG2细胞生长和凋亡及相关基因调控的研究[J];中国药科大学学报;2006年02期
11 张春虎;胡随瑜;李云辉;曹美群;;丹皮酚对人肝癌Bel-7404的抑瘤效应及其机制[J];中南大学学报(医学版);2006年05期
12 谢佐福;赵韬;魏莉;卢林;林声;张君逸;;多罗清泰颗粒对人肝癌细胞株信号转导基因表达的影响[J];中草药;2007年05期
13 雷海鸣;卞建民;詹志林;;肝癌细胞中PI3K信号通路对骨桥蛋白表达的影响[J];山东医药;2007年27期
14 黄建;王海波;葛盛芳;贾仁兵;黄青山;郑新民;;VEGF siRNA降低人肝癌细胞株SMMC7721的致瘤性[J];分子细胞生物学报;2007年05期
15 邢宏松;黄长文;傅华群;马景胜;蔡成行;;选择性iNOS抑制剂1400W对缺氧培养人肝癌SMMC-7721细胞株iNOS和VEGF表达的影响[J];实用临床医学;2008年09期
16 赵振军;张丽杰;鹿刚;张引娟;单保恩;;STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721细胞内的表达[J];临床检验杂志;2009年03期
17 彭忠田;申璀;谭德明;周应军;李红梅;;拉米夫定与N-壬基-1-脱氧野尻霉素联合应用抗-HBV的体外研究[J];江苏医药;2010年07期
18 蒋海;丁鑫鑫;刘鸿;谢宏霞;章康健;;Survivin介导的条件复制型溶瘤腺病毒表达IL-24蛋白对人肝癌细胞PLC作用机制探究[J];中国细胞生物学学报;2010年05期
19 许文婧;张双;张娜;杨阳;魏于全;邓洪新;;RNA干扰黏着斑激酶抑制人肝癌细胞sk-hep-1生长的实验研究[J];四川大学学报(医学版);2011年04期
20 陈葳,李旭,王莹,张利平;抗人肝细胞癌单链抗体基因的构建和表达[J];第四军医大学学报;2005年14期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 金晶;黄敏;刘耕陶;;耐5-FU的人肝癌细胞株Bel/5-FU细胞耐药机制的探讨[A];2002全国青年药理学英文学术会议论文汇编[C];2002年
2 张建军;黄育华;晏雪生;张赤志;盛国光;王伯祥;;富硒绿茶对人肝癌细胞株恶性表型逆转作用的血清药理学研究[A];2002全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2002年
3 张保琴;张海军;陈吉平;杨常青;;2,3,7,8-TCDD对人肝癌细胞株HepG2代谢的影响[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
4 刘小辉;彭小东;胡珍珍;赵清梅;何健;黎军和;钟小军;;ANXA10基因过表达对人肝癌细胞株HepG2的影响[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
5 王亚东;陈亚宝;朱家沂;严正;沈洪章;钱迎春;刘洪喜;周朋;赵晨星;汤晓怀;;核心岩藻糖基化γ-GT测定对人肝细胞癌的诊断价值[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年
6 王宏程;韩克军;石永玉;苏艳荣;庞学雯;王瑜;陈慰峰;;人肝细胞癌相关肿瘤抗原的分离及鉴定[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
7 吴育晶;金娟;王迪;魏伟;;儿茶素抑制HepG2细胞的增殖、迁移和促凋亡作用[A];第十届全国抗炎免疫药理学学术会议论文集[C];2010年
8 徐超;方志玲;;一种特异性强的兔抗人AMACR蛋白单克隆抗体的制备[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
9 马端征;王贺祥;;短柄黏盖牛肝菌核糖核酸酶的分离纯化与性质研究[A];海峡两岸第十届菌物学暨第三届食药用菌学术研讨会论文摘要集[C];2011年
10 何芳;曾文铤;朱科伦;;人参皂甙Rg3对裸鼠肝癌移植瘤模型微血管密度的影响[A];肝脏病防治学术研讨会及新进展学习班专刊[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘顺芳;癌基因DJ-1在人肝细胞癌中的作用及其机制研究[D];华中科技大学;2011年
2 吕丽虹;抗肿瘤药物促进人肝癌细胞释放携带热休克蛋白的exosomes及其高效诱导自然杀伤细胞介导的抗肿瘤免疫反应的体外研究[D];中山大学;2012年
3 朱倩;连接蛋白32在人原发性肝癌转移中的作用及其机制研究[D];华中科技大学;2010年
4 郑小红;创新脂毒性抗癌药物德氮吡格药效学及作用机制研究[D];重庆医科大学;2011年
5 孟玫;组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人肝癌细胞的诱导分化及其机制的研究[D];山东大学;2005年
6 陈永兵;Mdr1真核表达载体的构建及肝癌耐药细胞株HepG2/mdr1的筛选[D];四川大学;2005年
7 张明满;重组腺病毒介导反义MMP2基因抑制肝癌生长和侵袭的实验研究[D];四川大学;2005年
8 李明皓;重组腺相关Ⅱ型病毒介导人TIMP1基因抑制肝癌侵袭和生长的实验研究[D];四川大学;2007年
9 刘文斌;肝细胞癌血管生成拟态的临床意义及分子机制研究[D];天津医科大学;2011年
10 魏双;Ku80分子对人肝癌细胞增殖的影响及其机制的研究[D];华中科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 卢鹏;热休克转录因子1在人肝细胞癌中的表达及意义[D];第四军医大学;2012年
2 王晓瑜;黄芩素对人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移侵袭的影响[D];泸州医学院;2011年
3 叶伦;抑癌基因PLAGL1在人肝细胞癌中的表达及其意义[D];华中科技大学;2011年
4 逄世江;组织蛋白酶S在肝癌细胞中表达的研究[D];广西医科大学;2010年
5 李莉萍;白藜芦醇对人肝癌细胞株Bel-7402作用的实验研究[D];中南大学;2010年
6 吉兴旺;化癥散积颗粒对人肝癌细胞株QGY-7703杀伤作用的实验研究[D];长春中医药大学;2010年
7 苏俊俊;生长抑素抑制人肝癌细胞株(HepG2)生长及对p16基因表达水平影响[D];山西医科大学;2010年
8 朱海;广西乙肝病毒/黄曲霉毒素B_1双暴露人肝细胞癌中AKR1B10的表达[D];广西医科大学;2012年
9 朱建凤;HepG2人肝癌细胞株细胞亚群克隆异质性与肝癌干细胞的实验研究[D];大连医科大学;2010年
10 凌华毓;尼妥珠单抗联合表阿霉素对人肝癌细胞株HepG2体外生长的影响[D];安徽医科大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 李 戎 闫智勇 李文军 张天娥;中医药防治原发性肝癌机理研究进展[N];中国中医药报;2003年
2 记者 钱海红 郑莉丽;我国肝癌肝炎研究国际领先[N];健康报;2000年
3 李亚平;消化系癌裸鼠瘤株库建成[N];健康报;2003年
4 王雪飞;肝癌乳癌复发转移基因被“捕获”[N];健康报;2004年
5 ;人肝癌细胞器官特异性转移与基质金属蛋白酶分泌的关系[N];中国医药报;2003年
6 付冉;在治疗肝癌的前临床试验中AV-951表现良好[N];中国医药报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978