网膜成纤维细胞的活化及其促进卵巢癌网膜转移的机制研究

【摘要】：第一部分卵巢肿瘤患者网膜组织中肿瘤相关成纤维细胞的存在及其分布特点概述 目的 探讨上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)患者网膜组织中肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)的存在及其分布特点。 方法 免疫组化检测7例良性卵巢疾病、9例无转移卵巢癌和10例有网膜转移的卵巢癌病人网膜组织间质细胞α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况。 结果 良性卵巢疾病的网膜组织a-SMA仅表达于血管,基质成纤维细胞和间皮细胞无a-SMA表达；有网膜转移的卵巢癌病人网膜组织,肿瘤侵入网膜脂肪组织形成转移灶并出现大量的a-SMA阳性表达的成纤维细胞即CAFs。在部分无转移的卵巢癌网膜组织也可见间质细胞表达a-SMA。 结论 CAFs不仅存在于有卵巢癌转移的网膜组织,也存在于卵巢癌病人未发生转移的网膜组织。 第二部分网膜成纤维细胞的活化机制 目的 探讨网膜组织CAFs的来源及发生活化的机制。 方法 1.正常成纤维细胞(normal fibroblasts, NFs)与EOC细胞株SKOV3,OVCAR3, CAOV3, ES2共培养1-5天后,取NFs做PCR、Western blot和免疫荧光,检测a-SMA的表达和SMAD2的磷酸化；用EdU增殖实验检测其增殖水平。 2.用不同浓度的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)处理NFs2小时至2天后,取NFs做PCR、Western blot检测a-SMA的表达和SMAD2的磷酸化水平；用EdU增殖实验检测其增殖水平。 3.用TGF-β1受体抑制剂(A83-01)处理NFs,再与SKOV3细胞共培养或外源性TGF-β1处理,取NFs做PCR、Western blot检测a-SMA的表达和SMAD2的磷酸化；用EdU增殖实验检测其增殖水平。 结果 1.与各种EOC细胞株共培养4天后,NFs中a-SMA表达量均增加(P0.05),增殖细胞数增多(P0.05)。 2.用TGF-β1处理NFs2天后,NFs表达a-SMA增多,磷酸化SMAD2增多,并且有剂量依赖性(P0.001)。增殖细胞数也增多(P=0.002)。 3.用A83-01处理NFs可以减弱EOC细胞株共培养和TGF-β1处理引起的a-SMA和磷酸化SMAD2表达增多,和增殖细胞数的增多(P0.05)。 结论 EOC细胞株可以活化NFs,并且不依赖细胞之间的相互接触。TGF-β1在其中起介导作用。 第三部分网膜成纤维细胞对卵巢癌细胞粘附侵袭能力的影响 目的 研究成纤维细胞活化状态对EOC细胞侵袭粘附能力的影响及可能的机制。 方法 1.用经过不同处理方法预处理过的NFs组建3D培养模型,运用粘附和侵袭实验检测其对SKOV3细胞粘附和侵袭的影响。以不含成纤维细胞的3D模型为对照。 2.在NFs预处理过程中加入A83-01,或在3D培养基质胶中直接加入A83-01,检测对SKOV3细胞粘附和侵袭的影响。 3. Western blot检测与SKOV3共培养或经过TGF-β1处理的NFs中肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)表达。 4.在3D模型中加入HGF抑制剂,检测SKOV3细胞的粘附和侵袭能力。 5. Western blot检测与SKOV3共培养或经过TGF-β1处理后的NFs中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP2)的表达。 6.在3D模型中加入MMP2抑制剂,检测SKOV3细胞的粘附和侵袭能力。 结果 1.含有CAFs、SKOV3共培养的NFs和TGF-β1处理过的NFs的3D培养模型与对照组相比,SKOV3细胞粘附数分别增加4.77,3.08和3.14倍(P==0.007,P=0.022和P=0.018),侵袭细胞数增加6.81,3.80,and 6.06倍(P==0.0001,P==0.03和P=0.0005)。 2.在NFs预处理过程中加入A83-01,减弱了SKOV3细胞或外源性TGF-β1预处理引起的NFs促粘附侵袭能力的增加,SKOV3细胞粘附侵袭能力降低到未处理NFs组水平(P0.05)。SKOV3共培养或TGF-β1处理均可使NFs中HGF表达分别增高3.6倍(P==0.008)和4.3倍(P==0.002),加入A83-01可减弱这种增高(P==0.005)。 3.在3D模型中加入HGF抑制剂,明显抑制了活化成纤维细胞对SKOV3细胞粘附侵袭的促进作用(P0.01)。 4.与SKOV3间接共培养或TGF-β1处理均不能使NFs中MMP2表达增高,但是两者直接共培养3天后MMP2表达增高,比NFs单独培养增加3.69倍,比SKOV3细胞单独培养增加7.69倍(P0.001)。 5.在3D模型中加入MMP2抑制剂,明显抑制了活化成纤维细胞对SKOV3细胞粘附侵袭的促进作用(P0.05)。 结论 3D培养模型NFs的活化状态对SKOV3细胞粘附和侵袭有重要影响。EOC细胞可以通过TGF-β1促进成纤维细胞HGF的表达,通过与肿瘤细胞的直接接触促进成纤维细胞MMP2的表达,并且活化成纤维细胞对EOC细胞的促转移作用是部分通过HGF和MMP2来实现。 第四部分活化成纤维细胞对卵巢癌腹腔生长的体内研究 目的 探讨活化成纤维细胞对卵巢癌在裸鼠腹腔生长的作用。 方法 1.将SKOV3细胞注射入裸鼠腹腔建立裸鼠腹腔转移模型。实验分成四组：SKOV3单独注射组；SKOV3与NFs(5：1)混合注射组；SKOV3单独注射加A83-01组；SKOV3与NFs(5：1)混合注射加A83-01组。每组六只。 2.8周后,或裸鼠出现濒死状态时处死,观察肿瘤在腹腔内的分布。尽量取出全部的肿瘤组织,称重。 3.取部分肿瘤组织作HE染色和免疫组化检测a-SMA和MMP2的表达。Image Proplus5.1软件分析a-SMA阳性面积和MMP2染色强度。每只裸鼠的肿瘤做三张石蜡切片,每张切片取五个视野,取平均值作为每只裸鼠的蛋白表达量。 结果 1. SKOV3细胞与NFs混合腹腔注射产生的肿瘤重量是SKOV3细胞单独注射的4.12倍(P0.001),而A83-01减少了肿瘤重量的增加(P=0.0002)。但是SKOV3加A83-01组与SKOV3细胞单独注射组无差异。 2.HE染色和a-SMA免疫组化发现,混合注射组肿瘤组织发生明显的纤维化,为a-SMA阳性的活化的成纤维细胞。注射A83-01后,活化成纤维细胞数量减少(P0.001)。SKOV3单独注射组肿瘤组织液含有一定量的a-SMA阳性的活化的成纤维细胞,同样可被A83-01抑制(P=0.015)。 3.混合细胞组肿瘤组织MMP2表达量是单独注射组的5.51倍(P0.001)。注射A83-01可以抑制MMP2表达的增加(P0.001)。 结论 活化成纤维细胞可以促进卵巢癌细胞在裸鼠腹腔成瘤和转移生长,并且可以通过抑制成纤维细胞活化,抑制其促肿瘤作用。