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儿童急性白血病的实验及临床回顾性研究

熊昊  
【摘要】:第一部分小檗碱对Jurkat细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制的研究 目的 小檗碱(berberine, BBR)又名黄连素,近年来的药理学研究显示出其具有良好的抗肿瘤作用。我们先前的研究表明,小檗碱可协同TRAIL诱导白血病细胞凋亡,且其分子机制可能涉及抑制NF-κB/P65表达和caspase3, caspase8剪切活化。但是尚不清楚其他基因如P53或者MDM2是否参与小檗碱的这种作用。而Survivin是近年来研究较为热门的凋亡抑制蛋白家族成员之一,具有抑制凋亡、调节分化的双向作用,在正常的人体组织细胞几乎不表达。近年来又发现survivin的异构体survivin-2B和survivin-△Ex3对于癌症发生和发展中的生物学功能和作用与survivin并不一致。而survivin及异构体与MDM2、P53之间的相互作用机制也不清楚。因此本研究的目的: 1、小檗碱对Jurkat细胞的增殖、凋亡的影响及其分子生物学机制; 2、小檗碱对Jurkat细胞的作用机制是否不同于传统化疗药物柔红霉素。 方法 培养Jurkat细胞分为(1)空白对照组;(2)小檗碱组(25μM、50μM、100μM); (3)柔红霉素对照组(0.1mg/L, lmg/L,10 mg/L);分别培养12、24h后取样本用于后续实验。利用CCK-8法检测小檗碱及柔红霉素对每组Jurkat细胞的生长抑制率;同时采用流式细胞术AnnexinV/PI染色法检测其诱导Jurkat细胞凋亡的影响。用Real-time PCR及Western-blot方法检测小檗碱及柔红霉素作用Jurkat细胞后Survivin及其异构体Survivin-2B和Survivin.△Ex3与MDM2、P53基因表达mRNA与蛋白的变化. 结果 1、小檗碱具有明显抑制Jurkat细胞增殖并促进其凋亡的作用,其作用具有浓度依赖性与时间依赖性,呈现出随浓度增加和作用时间延长表现出明显增加的抑制率和凋亡率,与柔红霉素作用Jurkat细胞所表现的的趋势一致。 2、小檗碱抑制Survivin及其异构体Survivin-△Ex3的表达,促进Survivin-2B表达,具有时间依赖性和浓度依赖性,柔红霉素也表现出时间依赖性与浓度依赖性;但是二者的作用并不同步。 3、小檗碱促进P53表达,表现出与柔红霉素一致的时间依赖性,但是对于浓度依赖性二者表达并不一致。 4、小檗碱抑制MDM2的表达,表现出时间依赖性,没有浓度依赖性;而柔红霉素抑制MDM2表达表现出不完全时间依赖性和浓度依赖性。 结论小檗碱作用Jurkat细胞后通过下调Survivin.Survivin-△Ex3.MDM2的表达,上 调Survivin-2B.P53的表达从而抑制其增殖并促进凋亡,呈不完全的时间依赖性和浓 度依赖性,与柔红霉素作用机制并不一致,提示小檗碱治疗对柔红霉素耐药的白血病 细胞,或者与柔红霉素联合治疗白血病可能具有一定的临床价值。 第二部分几种较为特殊类型儿童急性白血病的临床回顾性研究 (一)新生儿—过性骨髓增殖异常:单中心回顾性研究 背景 21-三体异常的新生儿大约有10%可能会出现—过性骨髓增殖异常(Transient Abnomal Myelopoiesis, TAM),表现为在出生后的最初的数天时间内外周血出现并迅速积聚大量的原始细胞,并可能在数周至数月内自行消失。其中20-30%的患儿在今后数年内继发急性巨核细胞白血病(acute megakaryoblastic leukemia, AMKL)。 目的 探索中国新生儿21-三体染色体异常合并—过性骨髓增殖异常的自然病程,以及继发性AMKL的临床特征、治疗方法与长期预后。 方法 回顾性分析了在香港大学李嘉诚医学院玛丽医院收治并随访的4名21-三体异常合并 —过性骨髓增殖异常的新生儿。 结果 21-三体是这4例TAM病人原始细胞唯一确认的染色体异常。4名病人均在未接受化疗、仅接受对症治疗后外周血原始细胞自行消失,血细胞计数同时恢复正常。有3名病人继发AMKL,其诊断为AMKL的平均年龄为15个月;他们均接受了化疗治疗。这3名病人均维持至少6年的完全缓解。另外一名未继发AMKL的病人仅在其原始细胞中确定为21-三体的染色体异常,在其外周血原始细胞消失后体细胞和白细胞均未再发现染色体异常,这名病人也不具有典型Down's综合症的外貌。 结论 4名TAM病人尽管只接受对症支持治疗,仍然取得完全缓解,无1例死亡,其预后要优于文献报道类似疾病的病人预后。未来的研究将着重于额外的21号染色体上特定基因在诱发TAM及可能继发AMKL中的作用机制以及可能针对这些特定基因的靶向治疗;同时需要多中心合作研究以制定针对中国新生儿TAM以及继发AMKL的区分危险度的个体化治疗方案,以期在确保治疗效果的同时尽可能减少治疗相关性毒副作用。 (二)婴儿急性白血病的临床分析 目的 探讨婴儿白血病(IAL)的临床表现、细胞遗传学及分子生物学检查的特点。方法 对2005年1月1日~2009年12月31日华中科技大学同济医学院附属同济医院和武汉市儿童医院初诊的30例IAL患儿的临床特征及实验室检查资料进行回顾性分析。 结果 发热14例,皮肤出血5例,面色苍白、面色苍黄各4例。肝和(或)脾超过肋下5cm 4例;全身浅表淋巴结肿大8例;双肾肿大2例;骨质破坏5例;中枢神经系统浸润1例,病程2-75d。WBC为(1.06~681.37,中位数114.78)×109/L;外周血涂片均可见幼稚细胞;Hb(38~101,中位数67)g/L;PLT(1~355,中位数61)×109/。30例LAL患儿中ALL15例,ANLL 14例,分类不明1例。12例获得免疫表型检查结果,5例ALL均为B系,其中CD10表达3例;CD7与CD15共同表达1例;7例AML中CD19表达2例。12例获得染色体检查结果,其中3例异常。有13例IAL行融合基因检测,结果E2A/PBX1、BCR/ABL阳性各1例。30例中仅4例ALL接受化疗,但最终均放弃治疗。而对未治疗的26例4周后电话随访均死亡 结论 IAL病人在临床特征、免疫分型及遗传学等方面并没有表现出特异性。并且由于绝大多数IAL病人未得到有效化疗而导致其预后较年长儿为差。但本研究样本量较少,关于IAL病人化疗方案的制定及其长期预后仍然需要多中心协作研究解决。 (三)中国青少年急性淋巴细胞白血病采用儿童化疗方案治疗的长期效果:单中心回顾性研究 背景 10~18岁青少年急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)患者使用儿童化疗方案的治疗效果明显优于成人化疗方案,这表明非骨髓抑制化疗药物的强化治疗和更密集的鞘注治疗在改善青少年ALL患者预后的重要性。目的 明确中国青少年ALL患者的生物学特点和临床特征,以及使用儿童化疗方案治疗的长期效果。 方法 对在香港大学李嘉诚医学院玛丽医院使用儿童化疗方案治疗并随访的19名10~18岁青少年ALL患者进行回顾性分析。 结果 总共10名男性和9名女性患者接受了治疗。4例患者初诊时外周血白细胞计数100×109/L。4例免疫表型为T-ALL,其余为B-ALL.10例患者确定存在细胞遗传学异常。口服泼尼松治疗7天后15例患者反应良好。治疗第33天骨髓检查有2例没有缓解。尽管有84%(16/19)的患者获得完全缓解(Complete Remission, CR),但是有9例出现严重的治疗相关性毒副作用,其中2例死亡。4例复发,从CR到复发的平均时间为35个月(10~63个月)。平均随访时间为88个月(5~150个月)。7年总体生存率(Overall Survival,OS)和无事件生存率(Event-free Survival, EFS)分别为89.5±7.0%和72.9±10.4%。 结论 尽管青少年ALL患者使用儿童化疗方案可能出现较明显的治疗相关性毒副作用,但是其长期预后令人满意,并且不需要常规接受造血干细胞移植。 (四)造血干细胞移植在中国婴儿难治性和/或复发性急性白血病治疗中的作用:单中心回顾性研究 背景 即使多药联合化疗配合造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)治疗难治性/复发性白血病使得儿童白血病的长期预后获得明显改善,但是婴儿难治性和/或复发性白血病对于现有的化疗方案并没有从中明显受益,而HSCT是否有助于改善这一群体的预后并不清楚。 目的 探讨HSCT在改善中国难治性和/或复发性婴儿急性白血病的长期预后中的作用。方法 回顾性分析8名难治性和/或复发性婴儿急性白血病接受HSCT的治疗效果。 结果 8名病人中4名病人为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML),2名为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL),1名幼年型单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia, JMML),1名混合白血病(mixed lineage leukemia).4名病人初诊时的白细胞(white blood cell, WBC)计数50x109/L。2名病人检测出MLL基因阳性。4名病人接受了相关供体HSCT,3名接受了无相关供体脐血移植,1名接受了无相关供体HSCT。8名病人中有7名病人移植后中性粒细胞成功植入,其植入的平均时间为17天。4名病人移植后复发,尽管其中2名病人接受第2次移植,但是这4名病人全部死亡。另有1名病人死于移植相关性并发症。8名病人对移植的耐受性并不好。4名病人移植后出现4级急性移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)。5名病人出现肝静脉阻塞综合症(Venous occlusion disease, VOD)。3名存活的病人全部存在长期后遗症和/或并发症。 结论 HSCT治疗婴儿难治性和/或复发急性白血病仍然面临严峻的挑战。


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