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神经干细胞向胶质瘤干细胞迁移及对其生长特性的影响

张所军  
【摘要】:第一部分胶质瘤干细胞培养方式及其干细胞特性鉴定研究 目的:对比研究不同培养条件下胶质瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性差异。 方法:采用常规含血清贴壁、悬浮神经球、干细胞条件下laminin包被贴壁生长三种不同方法培养C6胶质瘤细胞;对比研究其不同的生长特点,包括三种培养条件下的细胞形态、生长曲线分析及自我更新能力;免疫荧光法、RT-PCR、Western Blotting和流式细胞术检测其干细胞和分化细胞表面标志物的表达差异;Hoechst33342荧光染色流式细胞术检测其侧群细胞的含量;裸鼠颅内原位成瘤实验分析不同培养条件下的肿瘤形成能力差异。采用统计学软件SPSS 17.0进行数据统计学分析。 结果:C6细胞在常规含血清贴壁培养(C6-Adh)、悬浮神经球干细胞培养(C6-SC-Sph)和干细胞条件下laminin包被贴壁培养(C6-SC-Adh)三种条件下表现出不同的生长方式和不同的增殖速度,以贴壁培养的C6-Adh和C6-SC-Adh增殖较快(P0.05);干细胞培养条件下的C6-SC-Sph和C6-SC-Adh具有较高的神经球形成能力及自我更新能力(P0.05);SP流式检测示C6-SC-Sph和C6-SC-Adh细胞群体中SP比例相对C6-Adh较高(P0.05);免疫荧光法、RT-PCR、Western Blotting和流式细胞术检测示CD133在三种细胞中均阴性表达,Nestin和βⅢtubulin均阳性表达,但在三种细胞之间表达水平无统计学差异;而与C6-Adh相比,GFAP低表达于干细胞培养条件下的C6-SC-Sph和C6-SC-Adh(P0.05);裸鼠体内原位成瘤实验及MRI和HE染色检测示三种细胞均具有体内成瘤性,但仅C6-SC-Adh与C6-SC-Sph生存时间相比有统计学差异(P0.05)。 结论:C6胶质瘤细胞系自身具有一定的干细胞特性,在转入干细胞条件下成神经球样培养后,仅部分GSC特性有所增加,体内成瘤性并没有增强,由此得到的细胞培养物称之为GSC不尽合理;干细胞条件下贴壁培养更有利于C6细胞GSC特性的富集,神经球样生长并不是GSC的必需条件。 目的:研究ATRA分化治疗对胶质瘤干细胞表型的影响。 方法:首先从神经球培养法人脑胶质瘤手术标本中富集培养原代胶质瘤干细胞;以全反式维甲酸ATRA(luM)对胶质瘤干细胞分化培养一周;然后流式细胞术对比检测胶质瘤干细胞与其分化细胞CD133阳性比例差异;免疫印迹法(Western Blotting)对比分析胶质瘤干细胞与其分化细胞干细胞标志物CD133和Nestin以及分化标志物GFAP表达水平差异;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Notchl在胶质瘤干细胞和其分化细胞表达差异;最后将胶质瘤干细胞与其分化细胞分别原位种植鼠脑(Bulb/c nude mice),观察ATRA分化对裸鼠生存时间的影响。 结果:神经球培养法有效从胶质瘤手术标本中富集培养呈悬浮球样生长的胶质瘤干细胞球(NCH421K、NCH441和NCH644)而ATRA诱导分化一周后的分化细胞(NCH421K-diff、NCH441-diff和NCH644-diff)呈多突起伸展样贴壁生长;流式细胞术检测示原代胶质瘤干细胞中CD133阳性细胞比例较高(11.02%-33.55%),而ATRA分化处理后CD133阳性细胞比例明显降低,P0.05;Western Bloting检测示胶质瘤干细胞在蛋白水平高表达CD133和Nestin,而ATRA诱导的分化细胞干细胞标志物表达降低,分化标志物GFAP表达增加,P0.05;RT-PCR检测示Notchl经ATRA分化后表达明显降低,P0.05;胶质瘤干细胞与其分化细胞经原位裸鼠脑内种植试验,提示ATAR分化后裸鼠生存时间明显延长,P0.05。 结论:ATRA可有效分化胶质瘤干细胞,降低干细胞标志物CD133和Nestin的表达;同时ATRA诱导分化后,Notch信号通路受明显抑制,裸鼠生存时间明显延长,提示ATRA可作为靶向胶质瘤干细胞的治疗措施。 目的:探讨神经干细胞(NSC)向胶质瘤干细胞(GSC)迁移的机制及对其干细胞表型和生长的影响; 方法:干细胞条件下悬浮神经球发培养U251和原代胶质瘤干细胞,并以含血清培养基对其进行诱导分化;以免疫荧光法、流式细胞术、Western Blot以及RT-PCR对其进行相关鉴定;收集胶质瘤干细胞(U251-SC和原代GSC)及其分化细胞条件培养液(CM),以Transwell小室法检测其对神经干细胞迁移的趋化作用;ELISA法检测条件培养液中VEGF、bFGF的分泌水平,并以EGF、bFGF为对照分析条件培养液对NSC的化学趋化作用;进一步以Dio和Dil分别标记NSC和GSC,体外混合培养观察NSC向GSC的迁移、以及对肿瘤干细胞球生长的影响。以Transwell小室法共培养NSC与GSC,流式细胞术、Western Blot和RT-PCR检测共培养前后胶质瘤干细胞表型变化;以有限稀释法96孔板细胞梯度成球来检测共培养前后胶质瘤干细胞自我更新能力差异;进步分同侧和对侧将NSC与GSC同时原位种植裸鼠颅内,观察活体颅内NSC向GSC的迁移及对裸鼠存活时间的影响。 结果:干细胞培养条件下的胶质瘤干细胞球,高表达干细胞标志物Nestin和/或CD133;分化后干细胞标志物表达下降、分化标志物GFAP表达增加(P0.05);GSC与其分化细胞比较,分泌高水平的趋化因子VEGF和bFGF(P0.05),并对NSC有高度趋化能力;体外混合接触培养也显示NSC向肿瘤干细胞球的迁移和包绕,并且能够显著抑制肿瘤干细胞球的生长(P0.05);经与NSC共培养后胶质瘤干细胞干细胞标志物Nestin和/或CD133表达下降,而GFAP表达增强;同时GSC成球能力降低(P0.05);颅内原位种植示NSC可向胶质瘤干细胞迁移并可延长裸鼠存活时间。 结论:胶质瘤干细胞较其分化细胞对神经干细胞迁移更具趋化能力,并且与其分泌高水平的生长因子有关;神经干细胞向胶质瘤干细胞球定向迁移可抑制肿瘤生长提高存活率。


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