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白藜芦醇数据库建立、深圳居民摄入量评估及生物效应、代谢学研究

彭晓琳  
【摘要】:当前,随着生活方式的转变和社会经济的发展,我国人群疾病谱发生了很大变化。慢性非传染性疾病(肥胖、高血压、心血管疾病、糖尿病和癌症等)患病率迅速上升,成为国人健康的主要威胁。大量研究表明,血管内皮是糖尿病及心血管疾病等众多慢性血管病的重要靶器官。高糖,高脂等外界因素刺激导致血管内皮分泌的多种生物活性物质间平衡失调,从而构成心血管、糖尿病等的共同病理生理基础,血管内皮功能障碍成为众多慢性疾病的早期标志性病理特征,而血管渗透性的增加又是内皮功能障碍的主要表现之一。因此,寻找有效干预措施拮抗内皮高通透性,保护血管内皮功能,是降低我国现今多种慢性血管性疾病患病率的关键。 白藜芦醇(resveratrol,简称Res)属于非黄酮类多酚化合物,化学名称为3,5,4’-三羟基二苯乙烯(3,5,4'-trihydroxystilbene),又称芪三酚。1992年,研究者在葡萄酒中检测到白藜芦醇并认为它与法国悖论现象(French paradox)有关,引起了学者们的极大兴趣。尤其是在1997年在Science杂志发表的一篇白藜芦醇具有抗癌功能的文章后,科研人员开始对它进行了大量的研究。至今,已有众多研究表明白藜芦醇具有抗癌、抗心血管疾病、抗突变、抗菌、抗炎、抗氧化、诱导细胞凋亡及雌激素调节等多方面有益人类健康的药理活性。 西方发达国家对膳食中主要植物化学物食物来源、摄入状况及其与健康的关系等展开了大量的研究,获得了重要科学数据。我国虽然以植物性食物为主,但日常植物性食物中白藜芦醇含量及其相关研究数据尚属空白。现有的白藜芦醇含量的研究多集中在葡萄、葡萄酒及花生等含量较高的食物,日常植物性食物中白藜芦醇的含量数据研究罕见。因此,完善食物中白藜芦醇含量的处理测定方法,分析我国各地区常见食品中白藜芦醇的含量与分布,建立植物性食物中的白藜芦醇含量数据库,准确评估居民日常白藜芦醇摄入状况,并深入研究其在机体内的代谢情况,是目前我国营养学领域亟待解决的重要课题,也具有十分重要的意义,值得广大科研工作者关注和重视。 大量的国内外研究证实植物性膳食(蔬菜、水果和谷类)与肥胖、心血管疾病、糖尿病以及肿瘤呈负相关关系,表明植物性食物在防治慢性非传染性疾病中具有十分重要的作用。作为多酚类的白藜芦醇也不例外。越来越多的研究表明白藜芦醇对心血管、糖尿病等疾病血管病变确实具有有效的防治作用。但目前关于白藜芦醇改善内皮功能失调的机制还不是很清楚。 本研究结合我国居民食物消费习惯,采集了华南,华北,华西及华中四个地区的数百种植物性食物,系统分析了白藜芦醇及其衍生物在我国居民日常消费的食物中的含量,旨在建立我国首个涉及面广,植物性食物种类较为齐全的白藜芦醇含量数据库,并据此初步评估我国深圳市居民从日常白藜芦醇摄入量,为进行我国居民白藜芦醇及其衍生物摄入水平和健康效应关系研究提供科学资料,也为制订我国居民主要植物化学物推荐摄入量和安全剂量等建议性标准奠定基础。同时,初步探讨白藜芦醇在体内的代谢动力学,并结合细胞和动物学实验研究,探讨白藜芦醇的健康效应和在防治代谢性疾病方面的作用及其相关机制。现将结果报告如下: 第一部分白藜芦醇含量数据库建立及深圳市居民摄入量初步评估 目的:建立一套较为完整的食物中白藜芦醇及其衍生物含量采集、处理、提取及分析方法,分析我国各地区常见食物样品中白藜芦醇及其衍生物的含量与分布,为我国建立白藜芦醇及其衍生物含量的首个全面而系统的数据库,并据此初步评估深圳居民从日常食物中摄入的白藜芦醇含量,为白藜芦醇的功效学研究奠定基础。 方法:采集我国华南、华北、华西及华中四个代表性地区居民日常食用的蔬菜水果,进行切块处理,冷冻干燥后,对比超声及浸提两种方法的萃取效率,摸索前处理条件及分析方法。最后选用最佳萃取条件,以Hypersil ODS-C18 (4.6mmx250mm,5μm)为色谱分析柱,柱温35℃,双流动相为A(甲醇:乙酸:水=10:2:88),B(甲醇:乙酸:水=90:2:8),流速1.0mL/min;进样量为20μtL,双荧光检测器波长分别为330nm与374nm。在该色谱条件下分析样品中的白藜芦醇及其衍生物含量。利用统一的食物频率调查问卷,调查深圳市15岁及以上居民日常各种食物消费情况及消费量,初步评估深圳市居民从日常食物中获得的白藜芦醇及白藜芦醇苷摄入量。 结果:样品切块处理较粉末状获得的白藜芦醇总量高,超声较浸提萃取效率高,且超声40min,样品-溶剂比为1:8时,萃取条件最佳。结合最佳萃取条件及HPLC分析发现,不同地区的同一种食物中白藜芦醇及白藜芦醇苷含量不同,同一地区的同一类蔬菜和水果中白藜芦醇及白藜芦醇苷含量也有差异,但其含量没有明显的地区及种类特异性。白藜芦醇苷是蔬菜水果中的主要存在形式,且其含量多高于白藜芦醇。同时,各地区相对独特的蔬菜水果也是居民白藜芦醇及其衍生物的主要摄入来源。含量最高者为华中地区水果中的红提皮,白藜芦醇总量超过了40μg/g。蔬菜中白藜芦醇总量最高者当属华西地区的芹菜,达到7.86μg/g。通过人群膳食调查发现,深圳市居民人均日常摄入的蔬菜约为332.1g,新鲜水果摄入相对少些,约为159.4g,谷类以大米为主,达到236.6g。根据本研究建立的白藜芦醇含量数据,我们初步估算深圳市居民每天从植物性食物中摄入的白藜芦醇总量约196.99μg,以一个60kg的成年人估算,约为3.28μg/kg.d。 结论:本研究建立了系统而相对完整的植物性食物收集,前处理,分离提取及检测分析白藜芦醇及其衍生物含量的一整套方法。对国内四个代表性区域(华南,华北,华西,华中)的数百种植物性食物中反式-白藜芦醇及反式-白藜芦醇苷进行了萃取分析,首次在我国建立了涉及面广、食物种类较齐全的植物性食物白藜芦醇含量数据库。作为植物性食物为主的中国,蔬菜瓜果中白藜芦醇总量虽然较低,却是居民摄入白藜芦醇及白藜芦醇苷的主要食物来源。根据本研究对深圳市居民每日从植物性食物中摄入的白藜芦醇总量进行的初步评估结果,首次发现居民从日常植物性食物中摄入的白藜芦醇总量相对较低,处于白藜芦醇动物功效学研究中的较低剂量范围,但是否达到了人群生物学效应的有效剂量尚待研究。因此,本研究有利于进一步研究居民膳食状况对地区特异性疾病的影响及二者的流行病学关联,对指导居民合理膳食、通过膳食营养途径促进健康和防治慢性疾病具有重要的意义。 第二部分白藜芦醇改善牛主动脉内皮细胞通透性 目的:通过高糖刺激牛主动脉内皮细胞,同时用白藜芦醇加以干预,探讨白藜芦醇对高糖诱导的牛主动脉内皮细胞高通透性的改善作用及可能的分子机制。 方法:33mmol/L高糖与不同浓度的白藜芦醇(0.1,1.0μmol/L)一起孵育牛主动脉内皮细胞,在培养单层细胞中用FITC-dextran (2.5μmol/L)观察漏过荧光量的变化,通过NO检测试剂盒分析上清中NO分泌量,用PCR和Western blotting技术分析eNOS及Cav-1基因、蛋白及其磷酸化表达水平。 结果:白藜芦醇可显著降低高糖诱导的内皮细胞高通透性,刺激eNOS磷酸化蛋白表达及NO产生(p0.05)。白藜芦醇对高糖处理后的牛主动脉内皮细胞Cav-1基因及蛋白表达水平均具有下调作用(p0.05)。用窖蛋白的抑制剂beta-环糊精(p-CD)预处理细胞,发现细胞通透性较高糖对照组显著性降低,且一氧化氮合酶蛋白及磷酸化表达水平均升高。而一氧化氮合酶抑制剂L-NAME则能促进内皮高通透性的发生,与白藜芦醇作用相反。 结论:白藜芦醇对高糖诱导的牛主动脉内皮细胞高通透性具有保护作用,其分子机制可能与白藜芦醇调节Cav-1/eNOS表达变化及NO水平有关,其中Cav-1在该过程中发挥了非常重要的作用,为白藜芦醇防治糖尿病等血管性疾病发现了—个重要靶点。 第三部分白藜芦醇对高糖高脂饮食大鼠的保护作用及其相关机制探讨 目的:建立高糖高脂动物模型,观察白藜芦醇对高糖高脂饮食大鼠体重,血糖血脂等的保护作用,研究白藜芦醇对高糖高脂饮食诱导的大鼠组织通透性及胰岛素敏感性的影响,并深入探讨白藜芦醇改善大鼠心血管系统组织通透性的相关分子机制。 方法:六周龄雄性Wistar大鼠45只,适应性喂养一周后,按初始血糖和体重随机分为5组,分别为对照组(正常组,高糖高脂组),白藜芦醇干预组(50、100、150mg/kg-bw三个不同剂量),每组9只,喂养13W。每天灌饲白藜芦醇,每周监测大鼠体重,每月监测大鼠血糖、血脂水平变化。12W末,进行葡萄糖耐量实验,胰岛素耐量实验。13W末,伊文思蓝染色法检测动物组织通透性,测定大鼠血糖、血脂及血胰岛素,分别通过PCR和Western blotting技术分析各组大鼠eNOS和Cav-1基因和蛋白表达水平的变化。 结果:①白藜芦醇灌饲4W,中、高剂量组大鼠体重显著降低(p0.05)。高糖高脂饮食饲养7W,模型组大鼠体重显著升高,白藜芦醇组大鼠较体重与HFS组相比均有显著性降低(p0.05),且呈明显的剂量效应关系(p0.05)。同时,高糖高脂饮食可使大鼠TC,TG升高(p0.05),而一定剂量的白藜芦醇长期作用则可预防高热量饮食诱导的脂代谢紊乱(p0.05)。②白藜芦醇对高糖高脂饮食诱导的主动脉、心脏、肝脏和肾脏组织通透性损伤均具有不同程度的保护作用。白藜芦醇组大鼠脑,肺及脾脏组织通透性较高糖高脂组虽有降低,但无显著性差异。在主动脉和心脏组织中,白藜芦醇拮抗高糖高脂饮食诱导的高通透性作用可能与其刺激eNOS活化及下调Cav-1基因和蛋白表达有关。③白藜芦醇还可显著降低大鼠血胰岛素水平和HOMA-IR指数,改善高糖高脂饮食诱导的大鼠葡萄糖耐量和胰岛素耐量异常(p0.05)。 结论:白藜芦醇可降低高糖高脂饮食诱导的大鼠体重、血糖血脂水平。本研究进一步在动物中发现白藜芦醇具有改善血管组织内皮通透性作用,且验证了白藜芦醇的内皮保护作用与机体内Cav-1/eNOS分子表达的变化有关。同时,白藜芦醇还显著提高高糖高脂饮食大鼠胰岛素敏感性,预防胰岛素抵抗的发生,但其具体机制还有待进一步研究。 第四部分白藜芦醇体内代谢学研究 目的:植物化学物的生物利用度和其在体内代谢途径,代谢物的组织分布、转化及排泄等方面的研究是确定植物化学物生物效应的很重要的基础。本研究旨在调查白藜芦醇在体内的生物利用度及其组织分布,为深入探讨其健康生物学效应和制订人体推荐摄入量奠定基础。 方法:六周龄Wister大鼠10只,适应性喂养一周后,分装于10个代谢笼中。实验前禁食10h,按体重灌胃给予大鼠50mg/kg白藜芦醇。选取Hypersil ODS-C 18(4.6mmx250mm,5μm)色谱柱,柱温35℃,双流动相为A(甲醇:乙酸:水=10:2:88),B(甲醇:乙酸:水=90:2:8),流速1.0mL/min;进样量为20μL,双荧光检测器波长分别为330nm与374nm高效液相色谱条件下分析大鼠血浆、尿液及各组织中反式-白藜芦醇及其糖基化物的含量。并进一步通过气质联用仪分析不同时间血浆中代谢产物的种类。 结果:白藜芦醇灌饲1h后血浆中反式-白藜芦醇浓度达到最大值,约4.79μg/mL而其糖基化物反式-白藜芦醇苷则到3h后才达到峰值,且其浓度达到反式-白藜芦醇原型含量的5倍,约23.78μg/mL。反式-白藜芦醇及其糖基化衍生物可在白藜芦醇摄入后24h内经尿液大量排泄到体外,排泄率超过摄入量的一半,其中原型占90%以上,余下者在体内各器官组织均有少量蓄积。但单次摄入与一个月多次长期口服摄入白藜芦醇后组织中的蓄积量均有显著性差异。短期蓄积量依次为:肝脏肺脏大脑小肠肾脏脾脏主动脉心脏;长期蓄积量依次为:肝脏肺脏肾脏小肠脾脏大脑主动脉心脏。其中肝脏的白藜芦醇蓄积量总是最高的(单次:2.01μg/g;30d多次:6.08μg/g),而心脏则总是蓄积最少的组织(单次:0.001μg/g;30d多次:0.006μg/g)。随着摄入次数的增加,肝脏、心脏、主动脉、’肾脏、小肠、脾脏和肺脏组织内蓄积的含量越多。其中肾脏中白藜芦醇糖基化物蓄积速度最快,30d长期摄入较单次摄入蓄积量多了十几倍。但在脑组织中,随着时间的延长,白藜芦醇的蓄积水平明显下降,几乎只有24h时的十分之一。同时,各组织内蓄积形式也不同。以白藜芦醇原型为主要蓄积形式的组织有肝脏和肺脏;主要以白藜芦醇糖基化衍生物为主要蓄积形式的组织有主动脉、心脏和脾脏。 结论:白藜芦醇进入大鼠体内后在血浆中主要以糖基化衍生物形式存在。动物体摄入白藜芦醇24h后,有超过一半摄入量的白藜芦醇可通过肾脏由尿液排出体外,其中白藜芦醇原型达到90%以上,这一现象在当前众多白藜芦醇代谢学的研究中尚属首例。白藜芦醇在动物体内各脏器均有蓄积,但总蓄积量相当低。其中肝脏蓄积的白藜芦醇及其衍生物含量在所有组织中是最多的,心脏总是最低的,且具有时间效应。随着白藜芦醇摄入次数的增加,机体内绝大部分组织中蓄积的白藜芦醇总量也增加,而大脑对白藜芦醇的蓄积量反而降低。同时,机体摄入白藜芦醇的次数不同时,代谢物的蓄积形式也表现出组织差异性。这些新的发现为白藜芦醇毒性及功效学研究提供了重要的理论依据。


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