收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

TRPC6介导的钙离子内流在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用

陈珊  
【摘要】:蛋白尿不仅是足细胞损伤的主要临床表现,也是导致足细胞损伤进行性发展的重要原因之一。白蛋白是尿蛋白的主要成分,已有的实验研究主要集中在其对肾小管上皮细胞的损伤如诱导其凋亡以及促进肾间质纤维化,而其在足细胞的直接损伤中作用尚未引起足够重视。蛋白尿状态下,足细胞首先暴露在大量白蛋白的环境中,其呈指状交叉的足突结构以及足突间裂孔隔膜分子可能受到蛋白负荷的影响而加剧足细胞的损伤,同时足细胞的损伤又将导致蛋白尿病情加重,如此形成恶性循环。TRPC6是新近发现的足细胞裂孔隔膜蛋白之一,也是一种非选择性阳离子通道蛋白,其主要通过介导钙离子内流发挥作用。已有的研究证实,在多种蛋白尿性肾脏病以及足细胞损伤的体外模型中足细胞TRPC6表达量增高,并与足细胞损伤程度相一致。由此推测TRPC6介导的钙离子内流是足细胞损伤的始动因素之一。然而,白蛋白过负荷对TRPC6离子通道功能的影响及其对足细胞的直接作用至今尚未明确。 本研究拟采用白蛋白过负荷体外细胞模型,探讨TRPC6在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用,并初步研究TRPC6通道在白蛋白过负荷状态下功能和表达量的改变,以期进一步阐明TRPC6介导的钙离子内流在蛋白尿所致足细胞损伤中的作用机理,并为蛋白尿的治疗提供潜在靶点。本实验研究具体内容概述如下: 目的:探讨TRPC6在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用。 方法:体外培养条件永生化小鼠足细胞,分为:空白对照组;白蛋白刺激组;pEGFP-N1转染组;TRPC6高表达质粒mTRPC6-EGFP转染组;scramble siRNA转染组;TRPC6 siRNA转染组;TRPC通道阻滞剂SKF-96365干预组;F-actin细胞骨架稳定剂Jasplakinolide干预组。(1)以Fluo 3-AM为钙离子探针,采用活细胞钙成像法检测白蛋白瞬时刺激对各组足细胞胞内钙离子浓度的影响。(2)Western blot法检测白蛋白过负荷后足细胞孔隔膜分子TRPC6和nephrin,内质网应激相关蛋白GRP 78以及caspase-12表达的的改变。(3)免疫荧光法检测白蛋白过负荷对足细胞损伤标志物desmin表达的影响。(4)以罗丹明标记的鬼笔环肽对足细胞F-actin细胞骨架染色,观察白蛋白过负荷对足细胞F-actin细胞骨架结构的影响。(5)Hoechst 33342活细胞染核观察白蛋白过负荷引发的足细胞凋亡及其细胞核形态的改变。(6)采用AnnexinV-FITC和propidium iodide双染法以流式细胞仪检测白蛋白过负荷所致足细胞凋亡率的改变。 结果:(1)大量白蛋白瞬时刺激可激发足细胞胞浆内钙离子浓度短时间内—过性增高,且呈白蛋白浓度依赖性。20 mg/ml白蛋白刺激引起的胞内钙离子增加幅度最为明显。分别以EGTA或thapsigargin预处理,以清除细胞外钙或阻断细胞内钙池,发现白蛋白刺激不但可激发细胞外钙离子内流还可引起胞内钙池钙离子释放。转染TRPC6高表达质粒后,足细胞对白蛋白刺激敏感性增加。而TRPC6 siRNA或TRPC通道阻滞剂SKF-96365可明显阻断白蛋白刺激引发的足细胞胞内钙离子浓度增高。(2)白蛋白过负荷后48 h,足细胞TRPC6蛋白表达量明显增高。而TRPC6 siRNA可明显抑制TRPC6蛋白表达。(3)20 mg/ml白蛋白孵育后48 h可引起足细胞desmin蛋白表达量显著增高,阻断TRPC6可改善desmin蛋白表达。(4)72 h白蛋白过负荷可导致足细胞F-actin细胞骨架结构破坏,与F-actin稳定剂jasplakinolide作用类似,阻断TRPC6可在一定程度上稳定足细胞骨架结构。(5)白蛋白过负荷48 h后足细胞GRP 78蛋白表达量增加,延长白蛋白刺激时间至72 h后足细胞内活化的caspase-12表达量增高。TRPC6 siRNA可部分阻断GRP 78蛋白表达和caspase-12蛋白活化。(6)20 mg/ml白蛋白孵育后96 h,足细胞凋亡数目明显增加,其形态学表现为细胞核呈质密浓染或碎片状质密浓染。(7)流式细胞仪分析结果显示,白蛋白过负荷引起足细胞凋亡率增加。阻断TRPC6蛋白表达或其通道功能,以及稳定足细胞骨架结构可降低足细胞凋亡率。 结论:(1)大量白蛋白瞬时刺激足细胞可引起TRPC6介导的钙离子内流增加。(2)长时间白蛋白过负荷可增加TRPC6蛋白表达量,引起足细胞骨架结构破坏,诱发足细胞内质网应激反应并最终导致足细胞凋亡。(3)干预TRPC6表达或阻断其通道功能可减少白蛋白过负荷引发的足细胞损伤,TRPC6可能成为治疗蛋白尿的新靶点。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张波;足细胞损伤及其应答[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2003年05期
2 陈铖,丁国华,尤燕舞;苯那普利对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的保护作用[J];中华肾脏病杂志;2004年03期
3 李金红;陶建瓴;李航;;足细胞损伤与糖尿病肾病的研究现状[J];中国医学科学院学报;2010年05期
4 孙绍军;杨杰;;尿沉渣中Podocalyxin的检测在肾小球疾病中的应用研究[J];现代检验医学杂志;2008年05期
5 洪亦眉;陈朝红;;足细胞损伤的病因和发病机制[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2009年01期
6 王允亮;张昱;;蛋白尿的足细胞损伤机制及中药干预的研究进展[J];中国中医药现代远程教育;2010年17期
7 刘金凤;刘中柱;;Ang-2在大鼠阿霉素肾病的表达及意义[J];黑龙江医药科学;2008年02期
8 郑亚莉;保莉;;高血糖与足细胞损伤的研究进展[J];宁夏医学杂志;2011年08期
9 陈立平;聂晚年;吴晓英;;足细胞损伤与糖尿病肾病相关性研究[J];实用医学杂志;2010年02期
10 戴厚永;郑敏;汤日宁;马坤岭;倪杰;李青;刘必成;;厄贝沙坦对早期糖尿病肾病大鼠足细胞损伤及整合素连接激酶的影响[J];中国病理生理杂志;2010年11期
11 谭会斌;傅淑霞;杨林;;缬沙坦联合苯那普利对糖尿病大鼠足细胞损伤的影响及肾脏保护机制的研究[J];中国中西医结合肾病杂志;2008年04期
12 刘莉莉;刘志红;郑春霞;陈朝红;李世军;孙骅;黎磊石;;足细胞损伤对糖尿病肾病患者预后的影响[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2007年06期
13 吕智美,甘华;足细胞损伤与糖尿病[J];中华老年医学杂志;2005年01期
14 张苏华,刘志红,李世军,陈惠萍,苏健,曾彩虹,黎磊石;Fabry病的临床表现及肾脏病理学特征[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2004年06期
15 司晓芸,贾汝汉,黄从新,丁国华,刘红燕;肾小球足细胞损伤在脂质肾损害发病中的作用[J];广西医科大学学报;2002年02期
16 王太华,李清初,于克波;足细胞与膜性肾病[J];中国中西医结合肾病杂志;2004年06期
17 姚健,黎磊石;第一届欧洲肾脏研究论坛简介[J];肾脏病与透析肾移植杂志;1994年04期
18 肖家诚,Manfred Wehrmann,Peter Ruck,Edwin Kaiserling,Burkhard Bultmann;肾小球足细胞损伤与糖尿病性肾病相关性研究[J];上海第二医科大学学报;2002年01期
19 沙玉根,张爱华;肾小球足细胞生物学研究进展[J];国外医学.泌尿系统分册;2004年01期
20 王太华,李清初,李秀春,钱家麒;足细胞与FSGS相关研究[J];国外医学.泌尿系统分册;2004年04期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 侯海晶;益气活血中药复方三芪口服液对早期糖尿病肾病的影响[D];广州中医药大学;2009年
2 杜君;氨氯地平和依普利酮联合应用在缓解盐敏感高血压所致肾脏损害中作用机制的研究[D];中国医科大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 姚琴;TRPC6在足细胞的表达及其与足细胞损伤修复相关性研究[D];大连医科大学;2008年
2 张强;依那普利和限食对肥胖相关肾病大鼠足细胞损伤的干预作用[D];山西医科大学;2008年
3 赵非;CD2AP在肾病综合征蛋白尿发生机制中的作用的研究[D];南京医科大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978