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肿瘤微环境中巨噬细胞、肥大细胞活化机制的研究

孙凌聪  
【摘要】:肿瘤微环境是肿瘤发生发展过程中所处的内环境,肿瘤微环境中各种成分之间的相互作用是肿瘤发生发展的决定因素。因此在进行肿瘤研究时,对于肿瘤微环境的探讨尤为重要。越来越多的证据表明,浸润到肿瘤微环境中的髓源细胞对肿瘤的生长和转移起到重要作用,其中包括巨噬细胞和肥大细胞。但其在肿瘤微环境中功能变化的机制尚不清楚。本研究旨在探讨巨噬细胞、肥大细胞在肿瘤发生发展中的作用,并初步探讨其机制。本研究分四部分,分别研究巨噬细胞和肥大细胞在肿瘤微环境中的功能变化: 第一、二部分:肿瘤微环境对巨噬细胞的影响。我们采用H22细胞和骨髓F4/80+细胞,即Gr-1+CD11b+F4/80+骨髓来源单核细胞(Bone marrow-derived monocytes, BMDMs)混合接种小鼠,或瘤内注射骨髓F4/80+细胞的方法,发现骨髓F4/80+细胞在肿瘤微环境中产生促瘤生长功能。因此我们采用了反复冻融法制备坏死肿瘤细胞释放物(molecules from necrotic tumor cells, NTC-Ms)模拟肿瘤微环境,发现NTC-Ms能促进肿瘤生长;且NTC-Ms诱导骨髓F4/80+细胞具有了MDSC表型,能抑制T细胞增殖。由于NTC-Ms中含有大量的内源性Toll样受体配体,我们采用肌肉内转染sTLR4表达载体的方法,观察是否TLR4参与了NTC-Ms对骨髓F4/80+细胞的诱导作用。结果显示:sTLR4能显著抑制肿瘤生长;当刚出现可触及肿瘤时(7d),sTLR4能使肿瘤组织内F4/80+细胞Argl基因转录水平下降,而Nos2和IL-12基因转录水平升高。我们进一步观察了肿瘤组织和肿瘤免疫治疗组织中F4/80+细胞的表型,发现均为Gr-1+CD11b+4/80+,而sTLR4同样也能增加肿瘤免疫治疗组织中F4/80+细胞Nos2和IL-12转录水平,增强4-1BBL/sPD-1肿瘤抑制作用;且更进一步降低了肿瘤免疫治疗组织中F4/80+细胞诱导T细胞凋亡的能力。以上结果表明;在肿瘤微环境中,NTC-Ms通过TLR4途径诱导巨噬细胞产生促瘤生长功能;肿瘤免疫治疗过程中,肿瘤细胞的破坏也可通过TLR4影响巨噬细胞。 第三、四部分:肿瘤微环境对肥大细胞的影响。我们采用骨髓来源肥大细胞(bone marrow-derived mast cells, BMMCs)和H22细胞混合接种或瘤内注射BMMCs的方法,发现BMMCs在肿瘤微环境中产生促瘤生长功能。由于SCF是肥大细胞分化成熟的重要因子,因此我们观察了SCF对BMMCs的作用,结果发现SCF预处理的BMMCs抑瘤作用减弱。接下来我们用NTC-Ms、TI-Ms模拟肿瘤微环境,发现NTC-Ms、TI-Ms预处理的BMMCs能促进肿瘤生长,而resveratrol、QNZ减弱了NTC-Ms的作用,提示TLR4和SCF可能参与了NTC-Ms对BMMCs的诱导作用。因此,我们首先证明了NTC-Ms和TI-Ms中含有功能性SCF,然后用SCF和TLR4的特异性配体LPS协同刺激BMMCs,发现BMMCs产生了促瘤生长功能;而在瘤内注射BMMCs的模型中,肌肉内转染sTLR4表达载体,则减弱了肥大细胞的促瘤功能,进一步说明SCF和TLR4配体增强了肥大细胞促瘤生长潜能。为了明确SCF和TLR4配体发挥作用的机制,我们观察了不同处理条件下,BMMCs脱颗粒、IL-10表达和对肿瘤生长的影响。结果显示,SCF/LPS、NTC-Ms和TI-Ms均能抑制肥大细胞自发脱颗粒,但不影响VEGF和PDGF的表达;且SCF/LPS、NTC-Ms和TI-Ms均能刺激BMMCs表达IL-10; resveratrol、wortmannin和QNZ可抑制NTC-Ms的作用。进一步研究发现,SCF和TLR4配体抑制肥大细胞脱颗粒和产生IL-10的功能涉及Tyr216-GSK3β磷酸化,其磷酸化抑制剂LiCl抑制肿瘤生长,消除了NTC-Ms、SCF/LPS对BMMCs自发性脱颗粒的抑制作用,且减弱了NTC-Ms、SCF/LPS诱导的BMMCs IL-10表达水平。以上结果表明,肿瘤微环境中的SCF和TLR4配体共同作用于肥大细胞,通过调节PI3K、NF-κB和Tyr216-GSK3β的磷酸化,调控肥大细胞脱颗粒和细胞因子释放,增强其促瘤生长功能。 综上所述,本研究探讨了肿瘤微环境对巨噬细胞和肥大细胞功能的影响,并初步探讨了其机制,为肿瘤的靶向治疗提供了理论依据。


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