620nm非相干红光对大鼠骨髓间充质干细胞的光生物调节作用

【摘要】：目的：(1)获得均一、稳定、可靠的大鼠骨髓间充质干细胞；(2)探讨620nm发光二极管(Light Emitting Diodes, LED)非相干光对大鼠骨髓间充质干细胞在增殖和成骨分化方面的影响；(3)研究在低能量光照促进的细胞增殖过程中mTOR信号蛋白的变化情况；(4)研究在低能量光照促进的成骨分化中昼夜节律基因的变化情况。 方法：(1)密度梯度离心法结合贴壁法分离间充质干细胞,体外扩增,镜下观察细胞形态,用流式细胞仪检测其表面标记物,分别作间充质干细胞的成骨、成脂肪和成软骨诱导培养,采用von kossa染色、油红O染色和阿利新蓝染色鉴定细胞的三向分化能力； (2)获取的骨髓间充质干细胞分别在普通培养基和成骨诱导培养基中培养,两种培养基中的间充质干细胞均分为四组,用620nm LED非相干光分别以0、1、2和4J/cm2的剂量进行照射,照射后采用CCK-8和EdU标记观察细胞增殖情况,采用ALP比活性检测、von kossa染色和多种成骨标志基因(Coll a 1,Alpl,Bglap and Runx2) RT-PCR来评估细胞成骨分化的情况； (3) 620nm LED非相干光照射分别以0、0.5、1和2J/cm2的剂量照射间充质干细胞,CCK-8检测细胞增殖情况,Western-blot检测总mTOR和磷酸化mTOR蛋白含量； (4) 620nm LED非相干光照射分别以0、1、2和4J/cm2的剂量照射成骨诱导培养基中间充质干细胞,von kossa染色观察细胞成骨分化情况,RT-PCR检测多个核心昼夜节律基因的表达(Cry1、Cry2、Per1、Per2、Clock、BMAL1). 结果：(1)获取的骨髓间充值干细胞呈长梭形,贴壁生长,流式细胞仪检测显示CD29、CD44高表达,CD34低表达在经过成骨、成脂肪和成软骨诱导培养后,von kossa染色示有大量钙结节生成,油红O染色示有胞浆内大量脂滴形成,阿利新蓝染色示细胞外基质中含有大量Ⅱ型胶原 (2)普通培养基中的间充质干细胞增殖加速,而成骨诱导基中的间充质干细胞无明显增殖,成骨诱导基中的间充质细胞成熟加速,而普通培养基中的间充质干细胞没有分化迹象； (3)细胞在光照下有明显的增殖,总mTOR的水平没有明显变化,但mTOR的磷酸化水平增高； (4)受光照的细胞有更多的钙结节生成,Cry2、Per2、Clock的表达水平有不同程度的上升。 结论：(1)密度梯度离心法结合贴壁法可获得均一、稳定、可靠的间充质干细胞； (2)低能量非相干光可以促进普通培养基中的间充质干细胞增殖,不能促进其向成骨分化,但可促进成骨诱导基中的间充质干细胞成骨分化并使其增殖速度减缓； (3)低能量非相干光可促进间充质干细胞增殖并激活mTOR信号通路； (4)昼夜节律基因可能参与调控低能量非相干光诱导的间充质干细胞成骨分化。