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冬虫夏草素对小鼠脑缺血复灌损伤的保护作用及机制研究

程震勇  
【摘要】:第一部分:冬虫夏草素对小鼠脑缺血复灌损伤的保护作用及机制研究 目的: 研究冬虫夏草素对小鼠脑缺血复灌损伤的保护作用并探讨其作用机制。 方法: 采用出生后6-8周健康成年雄性昆明种小鼠,随机分为4组(每组8只):假手术组、模型组、冬虫夏草素低剂量组(10mg/kg)冬虫夏草素高剂量组(20mg/kg)冬虫夏草素组小鼠灌胃给药(0.1ml/10g体亚),假手术组、模型组小鼠灌胃给双蒸水(0.1ml/10g体重),每天灌胃一次,连续药七天后,小鼠用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后行双侧颈总动脉结扎,缺血15分钟后复灌4小时,建立缺血复灌损伤模型。 结果: 1.冬虫夏草素对小鼠缺血复灌损伤后大脑皮层以及海马神经细胞的形态学影响:小鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)缺血15分钟复灌4小时后,可见模型组小鼠大脑皮层以及海马CA1区神经细胞明显损伤,如细胞核浓缩、核碎裂、核消失细胞深染等现象,正常神经细胞数目显著减少(与假手术组相比p0.01,n=5)。冬虫夏草素(10mg/kg)预处理后则明显减轻大脑皮层以及海马CA1区神经细胞损伤状况,神经细胞丢失数目显著减少(与模型组相比p0.05,n=5)。2.冬虫夏草素对小鼠缺血复灌损伤后大脑脂质过氧化程度的影响:假手术组SOD活力、MDA水平分别为93.54μ12.94 (U/mg. protein) (n=8)、1.83μ0.44 (nM/mg. protein) (n=8)。缺血15分钟复灌4小时后,脑组织内SOD活力降低48.5%(与假手术组相比p0.01,n=8)。MDA水平升高65.9%(与假手术组相比p0.01,n=8)。冬虫夏草素(10mg/kg)预处理后则明显减轻大脑脂质过氧化程度,脑组织内SOD活力明显升高(与模型组相比p0.05,n=8)。MDA水平明显降低(与模型组相比p0.05,n=8)。3.冬虫夏 草素对小鼠缺血复灌损伤后脑内氨基酸神经递质的影响:缺血15分钟复灌4小时后,小鼠大脑内五种氨基酸的含量明显增加,增加比例如下:天冬氨酸(144%),谷氨酸(117%),甘氨酸(328%),牛磺酸(121%),γ氨基丁酸(86%)(与假手术组相比p0.05,n=8)。冬虫夏草素(10mg/kg)预处理后则明显减少大脑内五种氨基酸的含量。降低比例如下:天冬氨酸(39%)、谷氨酸(28%),甘氨酸(60%),牛磺酸(23%),γ氨基丁酸(36%)(与模型组相比p0.05,n=8)。 4.冬虫夏草素对小鼠缺血复灌损伤后脑内基质金属蛋白酶3的影响: 小鼠脑缺血15分钟复灌4小时后,脑组织内基质金属蛋白酶-3表达增加191.5%(与假手术组相比p0.01,n=8)。冬虫夏草素(10mg/kg)了预处理后则明显减少大脑基质金属蛋白酶-3表达,降低45.8%(与模型组相比p0.05,n=8)。 5.冬虫夏草素对小鼠缺血复灌损伤后大脑皮层及海马各区NF-κB表达的影响 各组小鼠CA1区IKKa(IκB-kinase-a)的荧光密度(均值±标准差):假于术组67.66±8.72:模型组117.08±21.41:冬虫夏草素(10mg/kg)组为89.58±11.32:各组小鼠CA1区P65(是NF-κB的一种主要亚基,也称为RelA)的荧光密度(均值±标准差):假手术组63.53±8.94;模型组164.72±±19.03:给药组118.29±11.76。经SPSS13.0软件统计处理,模型组与假手术组荧光密度相比有极显著性差异(P0.01);冬虫夏草素(10mg/kg)组与模型组荧光密度相比有显著性差异(P0.05)。 结论: 1.冬虫夏草素(10mg/kg)对小鼠脑缺血复灌损伤具有明显的保护作用,其作用可能与降低脑缺血复灌后脂质过氧化程度,减少细胞外谷氨酸、天冬氨酸等兴奋性氨基酸含量,以及抑制细胞内基质金属蛋白酶-3的激活有关。2.冬虫夏草素在较高剂量组(20mg/kg)对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用不明显,其机制有待进一步研究。 第二部分:冬虫夏草素对小鼠全脑脑片氧糖剥夺复氧损伤的保护作用及机制研究 目的: 研究冬虫夏草素对小鼠脑缺血复灌损伤的保护作用并探讨其作用机制。 方法: 出生后(6-8周)健康成年雄性小鼠随机分为5组(每组8只):正常组、OGD模型组、冬虫夏草素组(20μM、40μM、80μM),各组小鼠经10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉断头后取脑,使用振荡切片机制备脑片,厚400μmm,置于持续通95%O2和50CO2混合气体的人工脑脊液(ACSF)中,在室温条件下孵育30分钟,以恢复脑片活性,再置于37℃恒温水浴箱中孵育30分钟后,更换无糖人工脑脊液,并通95%N2和5%CO2混合气体,进行氧糖剥夺损伤15分钟(正常组除外),然后重新更换人工脑脊液,通入95%O2和5%CO2混合气体孵育240分钟,建立脑片氧糖剥夺复氧损伤模型。用TTC染色和PI染色方法观察脑片损伤程度。将脑片孵育液收集,试剂盒检测LDH含量高效液相色谱法(HPLC)检测孵育液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸的含量;ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-10的含量。将脑片组织收集工提取蛋白,用Western-blot方法检测NF-κB通路的IKKa、P65和MAPK通路P-ERK (1/2)的表达。 结果: 1.冬虫夏草素对氧糖剥夺复氧损伤后小鼠脑片活性的影响:TTC染色结果、PI染色结果、孵育液中LDH检测结果显示在氧糖剥夺15分钟复氧4小时后,与正常组比较,模型组脑片损伤明显加重,而冬虫夏草素20μM和40μM处理组能显著减轻损伤。冬虫夏草素80μM减轻损伤的作用不明显。 2.冬虫夏草素对脑片氧糖剥夺复氧损伤后炎症细胞因子释放的影响。ELISA检测结果反映在脑片氧糖剥夺复氧损伤后,模型组中两种细胞因子IL-lβ和IL-10含量均有显著增加。冬虫夏草素20μM、40μM、80μM处理组均能显著降低炎症因子IL-1β分泌量,而40μM能显著增加IL-10分泌量。 3.冬虫夏草素对脑片氧糖剥夺复氧损伤后氨基酸神经递质释放的影响HPLC检测结果显示在脑片氧糖剥夺复氧损伤后,模型组孵育液巾谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸、Y氨基丁酸均显著升高,冬虫夏草素20μM、40μM处理组能明显降低谷氨酸和天冬氨酸的水平,20μM组能明显升高牛磺酸的水平。冬虫夏草素各处理组对于甘氨酸和γ氨基丁酸水平则有不同程度的降低。 4.冬虫夏草素对脑片氧糖剥夺复氧损伤后脑组织内NF-KB通路和MAPK之ERK(1/2)通路的影响 Western-blot实验证实在脑片氧糖剥夺复氧损伤后,与正常组相比较,模型组脑组织内IKKa、P65、P-ERK (1/2)的农达均显著增加,冬虫夏草素20μM、40μM、80μM处理组能明显降低IKKa、P65的表达,冬虫夏草素20μM、40μM处理组能明显降低P-ERK (1/2)的表达。 结论: 1.氧糖剥夺15分钟复氧4小时能引起脑片组织明显的损伤,孵育液中兴奋性和抑制性氨基酸含量均显著增加,炎症因子IL-1β、IL-10均显著增加,脑片组织内IKKa、P65、P-ERK (1/2)的表达均显著增加。 2.冬虫夏草素对氧糖剥夺复氧损伤有较好的保护作用,其作用机制可能与降低脑片复氧损伤后细胞外液中谷氨酸、天冬氨酸等兴奋性氨基峻含量,调节兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸平衡有关系,冬虫夏草素降低IKKa、P65、P-ERK (1/2)等表达反映其能阻断炎症通路,减少炎症介质如细胞因子IL-lβ的产生 3.冬虫夏草素20μM、40μM处理组对氧糖剥夺复氧损伤有明显保护作用。80μM处理组的保护作用不明显。


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1 陈震勇;郭莲军;;冬虫夏草素对小鼠胶原诱导性关节炎模型的治疗作用[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年
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