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适于微米切片的小鼠全脑标本制备方法研究

张斌  
【摘要】:神经解剖学在揭示脑的复杂结构和功能方面占有重要的地位。近年来众多科学家都在研究新的方法来获取全脑的显微结构信息,以便对脑进行跨层次的、系统性的研究。面对该需求,我们实验室开发了显微光学切片断层成像系统,它能够对标本进行连续微米切片,并实时对切片成像。通过这种成像方法可以在微米水平获取小鼠全脑标本的显微结构信息。 要基于该成像方法获取小鼠全脑显微结构信息,就需要制备适于微米切片的小鼠全脑染色标本。但是,传统标本制备方法中尚无对小鼠全脑尺度的大标本进行整体染色,同时标本适于微米切片的标本制备方法。为此本文开展了适于微米切片的小鼠全脑染色标本制备方法的研究。 研究了Nissl法染色小鼠全脑标本制备方法,以显示完整的小鼠脑中的神经元胞体的形态和分布。主要实验步骤为对完整的小鼠脑依次进行固定、染色、分色、脱水和包埋。小鼠全脑在Nissl染液中的浸染时间为10天,在梯度酒精-丙酮中进行分色、脱水的时间为9天,使用Spurr树脂包埋全脑标本,制备出了适于微米切片的小鼠全脑Nissl法染色标本。 研究了Golgi-Cox法染色小鼠全脑标本制备方法,以显示完整的小鼠脑中的神经元的形态、突起的行向以及神经元在脑中的空间位置。主要实验流程为对完整的小鼠脑依次进行固定、浸染、黑化、脱水和包埋。小鼠全脑在Cox液中的浸染时间约为半年,用氢氧化锂黑化全脑,黑化时间为1天,脱水时间为1天,使用Spurr树脂包埋全脑标本,制备出了适于微米切片的小鼠全脑Golgi-Cox法染色标本。 研究了标本的微米厚度切片质量评价方法。通过测量“切片贴紧刀面滑行的距离”来评价研制的标本的硬度是否适于微米切片,并确保获取到完好的切片图。经过多次实验,确定了合适的Spurr树脂包埋方法,结果显示所研制的标本制备方法可满足切片和成像的要求。 基于研制的小鼠全脑Nissl法和小鼠全脑Golgi-Cox法制备了相应的小鼠全脑标本,标本形态完整。利用显微光学切片断层成像系统对制备的标本进行了厚度1μm的连续切片和成像,分别获得了小鼠全脑经嗅球、端脑-间脑、中脑-脑桥、小脑-延髓完整冠状面的图像。结果表明,从脑的表层到深层均有大量神经元被染色,能清晰显示神经元的形态、结构和分布以及核团的结构等,同时证明研制的小鼠全脑标本制备方法能满足微米切片和成像的要求。


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