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褪黑素对大鼠脑出血后继发性脑损伤的作用及机制研究

李晓峰  
【摘要】:第一部分褪黑素对脑出血后小胶质细胞活化和氧化应激水平的影响 目的:通过观察大鼠脑出血后小胶质细胞活化程度与MDA动态变化以及褪黑素干预作用,探讨褪黑素对脑出血后小胶质细胞活化及氧化应激水平的影响。 方法:将Sprapue-Dawley系雄性大鼠150只随机分为正常组、假手术组、脑出血模型组(模型组)、褪黑素干预组(褪黑素组);脑出血模型组、褪黑素组组内随机分为术后12h、1d、2d、4d、7d共5个时间点,按Rosenberg法建立脑出血模型,褪黑素组每天腹腔注射1mg/ml褪黑素10ml/kg;透射电镜技术观察脑出血出血侧大脑皮层小胶质细胞形态变化;免疫组织化学方法观察各组大鼠脑组织OX42阳性细胞表达;黄嘌呤氧化法检测血肿周围脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸比色法检测脑组织丙二醛(MDA)含量。 结果:透射电镜结果显示,脑出血后2d时,模型组大脑皮层可见神经元肿胀,小胶质细胞活化、增殖,褪黑素组同侧皮层小胶质细胞活化不明显。免疫组化结果提示,假手术组、正常组大鼠仅见到少量OX42阳性细胞表达,模型组脑出血后12h时,血肿周围可见大量OX42阳性细胞表达,1d时逐渐达到高峰,7d时仍有表达,褪黑素组出血后各时间点,OX42阳性细胞表达明显低于模型组,差异有统计学意义(P0.05)。模型组脑出血后血肿周围脑组织MDA含量显著增高,1d达到高峰,7d时仍高于正常水平,SOD活性变化则与之相反;与模型组比较,褪黑素组MDA含量明显降低,SOD活性明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。 结论:褪黑素通过抑制脑出血后小胶质细胞活化、增殖,减轻神经细胞损伤。其机制可能与褪黑素通过显著减轻脑出血后脑组织氧化应激水平,抑制小胶质细胞从静息态向活化状态转变,从而减轻脑出血后继发性脑组织损伤。 第二部分褪黑素对脑出血后血肿周围继发性神经细胞损伤的影响 目的:通过观察脑出血及褪黑素干预后神经细胞凋亡和炎症因子、凋亡相关基因的表达,研究炎症反应、细胞凋亡在脑出血后继发性神经细胞损伤机制中的作用,探讨褪黑素对脑出血后迟发性神经细胞凋亡的保护作用及机制。 方法:采用Rosenberg法建立SD大鼠脑出血模型,随机分为正常组、假手术组、脑出血模型组、褪黑素干预组;采用TUNEL原位细胞凋亡检测评价脑出血后不同时间神经元凋亡率;采用透射电镜技术观察出血侧皮层神经元形态及微血管结构,免疫组织化学方法观察各组大鼠脑组织NF-κB、Caspase-3阳性细胞表达,实时荧光定量PCR技术对各组大鼠脑组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA转录水平的动态变化进行定量分析;Western blot技术分析各组大鼠脑组织Caspase-3、TNF-α蛋白表达水平。 结果:正常组、假手术组大鼠未检测到凋亡细胞,模型组出血后12h时血肿周围脑组织出现大量凋亡细胞,4d时达到高峰,7d时血肿周围仍检测到凋亡细胞,褪黑素组神经细胞凋亡率明显下降,7d时血肿周围未检测到凋亡细胞,差异具有统计学意义(P0.05)。透射电镜结果示,模型组脑出血后2d时出血侧皮层神经元胞浆肿胀明显,微血管周围明显水肿,褪黑素组皮层神经元形态基本正常。模型组及褪黑素组脑出血后12h时NF-κB阳性细胞表达明显升高,4d时达到高峰,褪黑素组脑出血后各时间点的NF-κB阳性细胞表达率明显低于模型组(P0.05)。脑出血后12h,模型组血肿周围出现Caspase-3(?)日性细胞表达,1d时达到高峰,之后逐渐降低,7d时仍高于正常组,褪黑素组脑出血后各时间点Caspase-3(?)日性细胞表达率低于模型组(P0.05)。荧光实时定量PCR结果示,脑出血后12h模型组Bax mRNA转录水平升高,1d时达到高峰,4d、7d时仍明显高于正常组水平,褪黑素组Bax mRNA转录水平各时间点均低于模型组,差异无统计学意义(P0.05);脑出血后12h时褪黑素组Bcl-2 mRNA转录水平升高,1d时达到高峰,4d、7d时仍明显高于模型组(P0.05)。脑出血后12h至4d,褪黑素组与模型组MMP-2 mRNA转录水平均逐渐升高,但两组间无显著差异,7d时褪黑素组MMP-2mRNA转录水平明显低于模型组,差异具有统计学意义(P0.05);模型组MMP-9 mRNA转录水平在脑出血后2d时明显升高并达到峰值,继而下降,7d时再次升高,褪黑素组MMP-9 mRNA表达峰值在出血后1d时提前出现,之后下降至正常组水平,7d时明显高于模型组(P0.05)。脑出血后各时间点,褪黑素组Caspase-3、TNF-α蛋白表达均低于模型组(P0.05)。 结论:脑出血后血肿周围神经细胞凋亡发生率与小胶质细胞活化程度以及炎症反应程度存在相关性,褪黑素可抑制炎性因子的活化和释放,减轻血管源性脑水肿,减少脑出血后迟发性神经细胞凋亡,其机制可能与褪黑素抑制小胶质细胞和NF-κB活化,调控基质金属蛋白酶转录,减轻炎症反应,同时上调Bcl-2基因表达,抑制(?)Caspase-3表达有关。 第三部分褪黑素对脑出血后神经损伤修复的影响 目的:通过观察大鼠脑出血后胶质源性神经生长因子、脑红蛋白、线粒体转录因子A的动态表达及褪黑素干预作用,研究神经细胞及线粒体自我修复功能在脑出血后继发性脑损伤机制中的作用,探讨褪黑素对脑出血后神经细胞内源性神经保护和神经修复功能的促进作用及机制。 方法:采用Rosenberg法建立SD大鼠脑出血模型、随机分为正常组、假手术组、脑出血模型组、褪黑素组。分别于术后6h、1d、2d、4d、7d时对大鼠进行神经行为学评分,透射电镜技术观察脑出血后皮层神经元线粒体形态;免疫组织化学方法检测各组大鼠脑组织胶质源性神经生长因子(GDNF)、脑红蛋白(NGB)阳性细胞表达;荧光实时定量PCR技术对各组大鼠脑组织GDNF、NGB、mtTFA mRNA转录水平的动态变化进行定量分析;Western blot检测各组大鼠脑组织GDNF蛋白的表达。 结果:各组大鼠脑出血体积无明显差异(P0.05),褪黑素组大鼠神经行为学评分低于模型组(P0.05)。免疫组化结果示,正常组、假手术组脑组织均可检测到少量GDNF、NGB阳性细胞表达,脑出血后12h模型组GDNF P阳性细胞表达明显升高,7d时仍明显高于正常组(P0.05),褪黑素组GDNF阳性细胞表达明显高于模型组,差异有统计学意义(P0.05)。脑出血后12h模型组NGB阳性细胞表达升高,1d时NGB阳性细胞表达减少,2d-7d时再次逐渐升高,褪黑素组NGB阳性细胞表达率高于模型组,差异具有统计学意义(P0.05)。荧光实时定量PCR结果示,脑出血后12h时褪黑素组GDNF mRNA转录水平升高达到峰值,之后逐渐下降,7d时仍高于正常水平,模型组脑出血后1d时GDNF mRNA转录水平升高达到峰值,而后逐渐下降,7d时仍高于正常水平;褪黑素组脑出血后12h时NGB mRNA转录水平升高到峰值,1d至4d逐渐下降,仍高于正常组水平,7d时NGB mRNA转录水平明显升高,模型组脑出血后1d时NGB mRNA转录水平显著升高并达到峰值,2d时迅速下降低于正常组水平,4d至7d时NGB mRNA转录水平再次明显升高。褪黑素组脑出血后12h至1d时mtTFA mRNA转录水平明显上调,模型组mtTFA mRNA转录水平在1d时升高至峰值,2d至7d时褪黑素组mtTFA mRNA转录上调水平高于模型组,差异有统计学意义(P0.05)。电镜结果示脑出血后2d时,模型组皮层神经元线粒体肿胀,线粒体数量明显减少、残存线粒体向细胞壁移位,褪黑素组神经元结构及线粒体形态基本正常。脑出血后12h、4d、7d时,褪黑素组GDNF蛋白的表达高于模型组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论:褪黑素对脑出血后神经细胞的功能修复具有促进作用,褪黑素可能通过诱导GDNF、NGB早期表达,同时上调线粒体转录因子A的表达,提高线粒体自我修复能力,从而具有促进内源性神经保护和神经修复作用。


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