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黄芩苷对小鼠巨细胞病毒肝炎的治疗作用及其机制研究

黄永建  
【摘要】:[目的] 1)在小鼠巨细胞病毒肝炎模型证实黄芩苷的治疗作用和抗病毒效应; 2)探寻黄芩苷诱导抗CMV免疫的作用及其可能环节和机制。 【方法】 1)黄芩苷的肝毒性实验:根据成人的中效剂量计算小鼠用药剂量为60 mg/kg,按等倍递加方式设计药物剂量梯度为60 mg/kg、120 mg/kg、240 mg/kg和480 mg/kg。正常小鼠腹腔注射不同剂量黄芩苷,每天1次,连续14天后检测小鼠血清谷丙转氨酶水平及肝组织病理变化,观察黄芩苷肝毒性作用; 2)动物模型建立:按照徐翼的方法,选择4.5周龄BALB/c小鼠腹腔接种在免疫抑制小鼠体内增毒的MCMV Smith株,建立MCMV播散性感染模型。在MCMV接种后24小时开始给予黄芩苷腹腔注射60mg/kg,每天1次,共14天;设立安慰剂对照组和正常对照组; 3)肝病变评估:于给药后3、7和14天观察肝脏组织病变,用肝组织病变活动性积分(HAI)评估肝组织病变,同时检测血清sALT反映肝细胞功能变化; 4)病毒学评估:用蚀斑法测定黄芩苷治疗14天唾液腺组织内感染性病毒量,并与安慰剂对照组比较; 5)Th1/Th2类细胞因子表达:分别于给药后3、7和14天取小鼠脾细胞,经刀豆素、灭活MCMV刺激体外培养48小时,收集脾细胞培养上清液,用双抗体夹心ELISA法检测上清中Th1类细胞因子IFN-γ水平,设立不加刺激物对照组。同时检测各时间点小鼠血清中Th2类细胞因子IL-4水平; 6)Th1和Th2细胞特异性转录因子TBX21和GATA-3蛋白表达:按上述时间点提取脾组织蛋白,用Western blot法检测Th1和Th2细胞特异性转录因子TBX21和GATA-3表达强度,设立内参蛋白,以校正值K进行半定量分析。 【结果】 1)黄芩苷的肝毒性作用:60mg/kg,120mg/kg,240 mg/kg和480 mg/kg腹腔注射黄芩苷共14天,未见小鼠死亡,未出现其他异常反应。各组小鼠血清ALT水平与正常对照组相比无明显差异,肝脏切片亦无明显异常病理变化; 2)肝功能改变:与正常对照组相比,安慰剂对照组小鼠ALT水平在3天时明显升高,7天时达高峰,14天时下降。与安慰剂组相比,黄芩苷治疗组ALT水平在3天时即有明显下降,7天时进一步下降,14天时接近正常; 3)肝组织病理改变:安慰剂对照组肝组织HAI均值在第3天达高峰,以后逐渐下降;黄芩苷治疗组肝组织HAI均值也在第3天达高峰,但肝损害明显轻于安慰剂对照组,以后肝病变逐渐减轻,在第7天和14天时HAI均值都显著低于安慰剂对照组; 4)唾液腺感染性病毒量变化:黄芩苷治疗14天时,小鼠唾液腺的感染性病毒量明显低于安慰剂对照组; 5)Th1类细胞因子表达:黄芩苷治疗组和安慰剂对照组脾细胞上清中IFN-γ都在7天时达高峰,在3天、7天和14天时都高于正常对照组水平,有统计学差异。与安慰剂组比较,黄芩苷治疗组在3天和7天时都显著高于安慰剂对照组,但到14天时,黄芩苷治疗组已明显低于安慰剂组; 6)Th2类细胞因子表达:安慰剂对照组3天时血清IL-4显著低于正常对照组,第7天升至正常水平;到第14天显著高于正常对照组。黄芩苷治疗组IL-4水平在3天时亦明显低于正常对照组;第7天达高峰,略高于正常对照组,但明显高于安慰剂组;第14天仍略高于正常对照组,但明显低于安慰剂组。 7)TBX21蛋白表达:安慰剂对照组3天时TBX21蛋白表达略低于正常对照组;但7天和14天时都明显高于正常对照组;黄芩苷治疗组3天时TBX21蛋白表达显著高于正常对照组及安慰剂组;7天时达高峰,14天时略有下降,亦都明显高于正常对照组,但与安慰剂组接近; 8)GATA-3蛋白表达:安慰剂组和黄芩苷治疗组3天时GATA-3蛋白表达都显著低于正常对照组;但在7天和14天时都接近正常对照组表达水平,而黄芩苷治疗组与安慰剂组之间比较无明显差异。 【结论】 1)使用高达8倍中效剂量的黄芩苷对小鼠肝脏组织无毒副作用,表明黄芩苷是一种安全的中药制剂; 2)在整体水平,黄芩苷能显著减轻MCMV感染所致肝组织病理损害,促进sALT恢复正常,减少机体唾液腺内感染性病毒量。证明黄芩苷在体内具有抗巨细胞病毒效应,并对MCMV肝炎有治疗作用; 3)在MCMV急性感染早期,机体主要启动Th1介导的细胞免疫来快速清除病毒; 4)黄芩苷在MCMV急性感染早期可明显上调TBX21蛋白表达进而促进Th1细胞免疫应答而有利于机体清除病毒,并对MCMV诱导的Th1/Th2细胞网络改变有一定调节作用。


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