异氟烷诱导的发育期大鼠大脑神经毒性及米诺环素的保护作用

【摘要】：异氟烷是目前临床麻醉中常用的吸入麻醉药之一,自1982年问世以来已经在临床使用了将近20年时间。异氟烷适用于包括婴幼儿在内的各年龄段的手术患者,应用范围广泛。但是,自1999年首先发现NMDA受体阻断剂能引起发育期大鼠发生神经元广泛凋亡以来,有关异氟烷是否具有发育期神经毒性的问题迅速引起麻醉工作者、神经学家和患者的广泛关注 目前已有研究发现,发育期临床相关浓度和时间的异氟烷麻醉能诱导大鼠中枢神经系统包括大脑皮层、海马、丘脑以及脊髓等部位的神经元凋亡增加；能影响发育期神经元的神经突的生长速度和突起的数量；并且发育期的异氟烷麻醉能引起一定时间后大鼠的行为学改变。然而,目前研究中仍有许多争议的地方,特别是异氟烷引起神经毒性的机制和发育期异氟烷麻醉后是否能遗留长期的结构和行为学改变及机制等方面。此外,目前尚缺乏能针对异氟烷诱导的发育期神经毒性机制的,能有效预防或消除此种毒性作用的药物。 本研究拟首先通过观察异氟烷麻醉对发育期大鼠皮层和海马神经元凋亡、远期神经元密度和学习记忆能力、皮层和海马前炎症因子mRNA表达和相关信号通路的影响,明确临床相关浓度异氟烷对发育期(出生后7天,P7)大鼠的神经毒性作用及可能机制,并为下一步的干预研究提供可靠的基础。进而通过离体和在体研究观察米诺环素对异氟烷诱导的发育期神经毒性的保护作用,为有效减轻或消除异氟烷的发育期神经毒性提供药物选择。这些研究预期将为临床上更加科学、更加安全使用异氟烷提供理论依据。 1、明确异氟烷对发育期大鼠皮层和海马神经元凋亡和远期神经元密度的影响； 2、研究异氟烷对发育期大鼠大脑前炎症因子mRNA表达的影响,探讨可能机制； 3、明确发育期异氟烷麻醉对大鼠远期学习记忆能力的影响； 4、观察米诺环素对异氟烷诱导的大鼠发育期神经毒性的保护作用。 1、凋亡神经元统计和神经元密度计算 P7 Sprague-Dawley (SD)大鼠18只,随机分为对照组(C组)和异氟烷麻醉组(A组)。A组大鼠35℃恒温下1.5%异氟烷麻醉6h,C组自主吸入空气6h。每组取3只大鼠,行动脉血气分析。每组各另取3只大鼠用免疫组织化学法检测大脑皮层和海马active caspase-3阳性神经元,计算阳性率。其余大鼠继续饲养至出生后60 d后用免疫组织化学法检测大脑NeuN表达,比较两组大鼠皮层神经元密度。 2、观察前炎症因子mRNA动态表达和IκBα蛋白变化 P7 SD大鼠64只,随机分为对照组(C组)和异氟烷麻醉组(A组)。A组大鼠35℃恒温下1.5%异氟烷麻醉6 h,C组自主吸入空气6 h。A组于麻醉前(T0,基础状态)、麻醉2h (T1)、4h (T2)、6h (T3)、麻醉停止后4h (T4)、6h (T5)、12h(T6))、24h(T7)时,C组在对应时点各取4只大鼠,提取总RNA,实时定量PCR(Real-time PCR)测定海马和皮层IL-1βmRNA、IL-6mRNA及TNF-αmRNA的表达水平。提取总蛋白,Western blot测定IκBα蛋白含量。 3、水迷宫实验检测大鼠远期学习记忆能力 P7 SD大鼠20只,随机分为对照组(C组)和异氟烷麻醉组(A组)。A组大鼠35℃恒温下1.5%异氟烷麻醉6h,C组自主吸入空气6h。待大鼠麻醉苏醒后,回笼继续饲养至出生后60 d,行Morris Water Maze水迷宫实验。观察大鼠在平台隐藏实验和平台转移实验中的差别。 4、米诺环素对原代培养神经元的保护作用 取新生SD大鼠皮层,神经元原代培养于96孔板中,培养5d后,随机分为对照组(C组)、异氟烷麻醉组(A组)、米诺环素1μmol/L组(M1组)及米诺环素10μmol/L组(M2组)。C组神经元在37℃下空气处理6h,A组神经元在37℃下用1.5%异氟烷处理6 h,M1和M2组神经元分别在加入米诺环素1μmol/L/10μmol/L 10min后同A组一起进行异氟烷处理。相差显微镜下观察4组神经元形态,MTT检测神经元活性,TUNEL法检测神经元凋亡。 5、米诺环素对发育期大鼠的保护作用 P7 SD大鼠45只,随机分为对照组(C组)、异氟烷麻醉组(A组)、米诺环素组(M组)。A组大鼠分别在35℃恒温下1.5%异氟烷麻醉6 h,C组自主吸入空气6 h,M组大鼠分别在麻醉前腹腔注射米诺环素45mg/kg后同A组一起麻醉。A组、M组于麻醉前(T0,基础状态)、麻醉2h (T1)、4h (T2)、6h(T3)、C组在对应时点各取3只大鼠,提取总RNA,Real-time PCR测定海马IL-1βmRNA、IL-6mRNA及TNF-αmRNA的表达水平；提取T2时间点总蛋白,Western blot测定IκBα蛋白含量。每组在T3各另取3只大鼠检测大脑皮层active caspase-3阳性神经元并计算阳性率。 1、凋亡神经元数量和神经元密度 A组大鼠皮层active caspase-3阳性神经元数量明显多于C组(P0.05)。两组大鼠海马阳性神经元数量差别无统计学意义。两组大鼠远期皮层神经元密度相当。 2、前炎症因子mRNA动态表达和IκBα蛋白变化 C组各时点海马IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA比较差异无统计学意义(P0.05)；与C组比较,A组海马T1～5时IL-1βmRNA表达上调,T2、T3时IL-6 mRNA表达上调,T1～6时TNF-αmRNA表达上调(P0.05)。A组IκBα蛋白在各个时点的表达均较C组下降(P0.05)。 3、大鼠远期学习记忆能力 在4天的训练过程中,两组大鼠的寻台潜伏期都进行性缩短,但是两组大鼠在寻台潜伏期、目标象限停留时间和穿越平台次数等指标上的差异无统计学意义。 4、米诺环素对原代培养神经元的保护作用 A组神经元出现胞体肿胀、变形等改变；M1组神经元形态与A组接近,M2组神经元形态改变不明显,与C组相近。MTT结果显示A组、M1组神经元活性低于C组、M2组(P0.05)。A组、M1组凋亡神经元数目明显多于C组、M2组(P0.05)。 5、米诺环素对发育期大鼠的保护作用 M组皮层神经元凋亡明显少于A组(P0.05)。T1～3IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达均低于A组(P0.05)。M组IκBα蛋白表达水平高于A组(P0.05)。 1、1.5%异氟烷麻醉6h能诱导发育期SD大鼠皮层神经元凋亡增加,但是对远期皮层神经元密度和学习记忆能力没有影响； 2、1.5%异氟烷麻醉可短暂上调发育期大鼠海马IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA的表达；这种上调作用可能是由NF-κB/IκB信号通路激活引起； 3、米诺环素在体外和体内均能减轻异氟烷诱导的大鼠发育期神经元凋亡和前炎症因子升高,具有保护作用。