启动子区域甲基化状态与炎症细胞TNF-α分泌关系及调控因素的研究

【摘要】：研究目的： 测定人单核细胞系THP-1细胞在炎症刺激时肿瘤坏死因子α(TNF-a)表达分泌的规律,确定其分泌峰值时间；研究TNF-α基因启动子区域散在CpG双核苷酸结构甲基化状态与蛋白分泌和基因表达的关系；探讨TNF-α基因启动子区域散在CpG双核苷酸结构甲基化状态影响其基因表达的调控因素。 研究方法： 采用酶联免疫分析(ELISA)法检测人单核细胞系THP-1细胞在未受到炎症因子刺激时,其TNF-α表达分泌水平；使用终浓度为1μg/ml的脂多糖(LPS)刺激人单核细胞系THP-1细胞,采用ELISA法检测刺激不同时间时细胞培养液上清TNF-α分泌水平。对不同刺激时间分泌量与未刺激时分泌量进行比较,确定THP-1细胞在受到终浓度为1μg/ml的脂多糖刺激后,TNF-α分泌高峰时间和分泌下降时间。独立进行4次上述测定,结果以刺激不同时间的分泌量与未刺激时分泌量比值的平均数±标准误表示。对刺激后分泌高峰时间和分泌下降时间其分泌水平进行统计学分析,P0.05为差异具有统计学意义。同时采用实时定量PCR方法测定THP-1细胞TNF-α基因表达水平。采用重亚硫酸盐转化基因测序法测定THP-1细胞在未受到炎症刺激时TNF-α基因启动子区域的甲基化状态。使用终浓度为1μg/ml LPS刺激THP-1细胞,采用重亚硫酸盐转化基因测序法测定THP-1细胞在LPS刺激分泌高峰时TNF-α基因启动子区域的甲基化状态,以及受刺激后分泌下降时TNF-α基因启动子区域的甲基化状态。每个时间点样本选取5个克隆进行测序,结果以所测得CpG双核苷酸结构甲基化数占扩增区域总CpG双核苷酸结构数的百分率表示。采用卡方检验对测序结果进行统计学分析,P＜0.05为差异具有统计学意义。将未刺激时、刺激分泌高峰时期、刺激分泌下降时期TNF-α表达分泌量与对应时间点其基因启动子区域的甲基化状态进行对比。使用实时定量PCR方法测定甲基化CpG结合蛋白表达量。并与相应时间点TNF-α基因启动子区域甲基化状态及TNF-α分泌的关系进行研究。 实验结果： 受到终浓度为1μg/ml的LPS刺激后,THP-1细胞迅速开始产生TNF-α,1 h过后升幅明显增加,在4h达到分泌高峰水平,浓度为未刺激时的48.9±1.06倍。之后快速下降,至8h,已有明显下降,浓度为未刺激时的36.3±1.65倍。至12h,浓度已降至峰值一半以下。刺激4h与未刺激时相比,TNF-α分泌量明显升高(P＜0.01),其差别有统计学意义。刺激8h与刺激4h相比,TNF-α分泌量明显下降(P0.01),其差别有统计学意义。TNF-α基因启动子区域无典型CpG岛结构,其启动子-344bp到+57 bp区域内,存在12个散在CpG双核昔酸结构,其中-344bp到转录起始位点(TSS)区域内,存在11个散在CpG双核苷酸结构。未受到LPS刺激时,该11个散在CpG双核苷酸均处于甲基化状态；刺激4h时,有4个处于甲基化状态；刺激8h时,有9个处于甲基化状态。未刺激时,5个克隆总体甲基化率为100%,刺激4h时,5个克隆总体甲基化率为21.8%,刺激8h时,5个克隆总体甲基化率为41.8%。刺激4h时与未刺激时相比,TNF-α基因启动子区域甲基化率明显下降,差别具有统计学意义(P0.01)；刺激8h时与刺激4h时相比,TNF-α基因启动子区域甲基化率明显上升,差别具有统计学意义(P＜0.05)。各时间点甲基化率与相应时间点TNF-α分泌量比值之间呈明显负相关(r=-0.99,P0.01)。未受到LPS刺激时,甲基化结合蛋白(MBD1、MBD2、MeCP2)表达量均较高；刺激4h后,MeCP2表达量明显降低。MBD1、MBD2表达量较低；刺激8h后,MBD1、MBD2、MeCP2表达量又升高。 实验结论： 1. THP-1细胞TNF-α表达分泌量与LPS刺激明显相关。未受到LPS刺激时,TNF-α表达分泌量较低。受到LPS刺激后迅速开始产生TNF-α,1h过后升幅明显增加,在4h时达到分泌高峰水平,之后快速下降,至8h时,已有明显下降。TNF-α表达分泌呈现快速开始,快速升高并快速下降的规律。 2. TNF-α基因启动子区域散在CpG双核苷酸结构甲基化状态与THP-1细胞是否受到炎症刺激,以及受刺激时间明显相关。即未刺激时,总体甲基化水平很高；刺激4h,总体甲基化水平较低；刺激8h,总体甲基化水平较高。 3. THP-1细胞TNF-α表达分泌量与TNF-α基因启动子区域散在CpG双核苷酸结构甲基化状态呈明显负相关性。 4. TNF-α基因启动子区域散在CpG双核苷酸结构甲基化状态可能通过甲基化CpG结合蛋白影响其基因表达。