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五甲基槲皮素“棕色化”白色脂肪细胞及成年小鼠心脏c-kit+细胞研究

韩毅  
【摘要】:第一部分五甲基槲皮素“棕色化”白色脂肪细胞肥胖现已成为全球性的公共卫生问题,但是至今仍缺乏可长期使用且安全有效的减肥药物。棕色脂肪组织可将脂肪组织储存的多余能量转换为热量,因此认为将白色脂肪转化为棕色脂肪,即“棕色化”白色脂肪细胞,是一个治疗代谢性疾病的新靶点。除了β3受体激动剂、PPARγ激动剂之外,至今仍未有药物可达到上述目的。而这两种药物因为心血管等副作用在临床使用中受到限制。本研究证明:五甲基槲皮素具有减肥降脂的作用,其作用机制与“棕色化”白色脂肪细胞有关,可能会成为一种更加安全有效的治疗代谢性疾病的药物。 一、五甲基槲皮素“棕色化”3T3-L1脂肪细胞 目的:研究五甲基槲皮素对3T3-L1脂肪细胞的降脂作用及机制。方法:分别采用MTT,油红O、Janus Green B染色,葡萄糖、甘油三酯、甘油定量测定,RT-PCR,western blot, Realtime PCR的方法,检测PMQ对3T3-L1的增殖、分化、糖消耗、细胞内甘油三酯、脂解、线粒体生成、棕色基因表达的影响,并对其作用于脂肪细胞分化的阶段进行研究。结果:PMQ不影响3T3-L1前脂肪细胞的增殖,减少细胞内脂质合成,增加葡萄糖消耗,增加细胞内线粒体生成,促进UCP-1 mRNA和蛋白表达,上调PGC-1α, C/EBPα, PRDM16的mRNA表达,增加PPARγ、PPARα的蛋白表达。结论:PMQ可以“棕色化”3T3-L1脂肪细胞,并作用于细胞分化的早期阶段。 二、五甲基槲皮素对正常昆明小鼠的作用 目的:研究五甲基槲皮素对成年昆明小鼠的作用。方法:成年昆明小鼠45只,随机分为Vehicle, PMQ 2.5、5、10 mg/kg, RSG 5 mg/kg,五组,每组9只,每周监测体重、进食量,灌胃给药2周后,处死,称取棕色脂肪重量,并对白色脂肪组织中的相关“棕色”基因进行检测。结果:PMQ短期灌胃给药对正常昆明小鼠的体重、进食量、棕色脂肪重量没有影响,但可以上调UCP-1,PGC-1α, C/EBPαmRNA表达。 三、五甲基槲皮素对C57BL/6小鼠高脂饮食诱导肥胖模型的作用 目的:研究五甲基槲皮素对C57BL/6小鼠高脂饮食诱导肥胖模型的作用。方法:C57BL/6小鼠4~5周龄36只,随机分为SFD, HFD, HFD+PMQ三组。其中HFD+PMQ组高脂饲料中添加0.04%PMQ。每周监测体重、进食量,给药20周后,测量各组体征相关参数及血生化指标检,采用免疫组化的方法测定白色脂肪组织中线粒体的量和UCP-1蛋白表达,并用Realtime PCR的方法对白色脂肪组织中的“棕色基因”mRNA水平进行检测。结果:PMQ对HFD模型小鼠有减少腰围,降低LEE指数,减轻白色脂肪重量,减小脂肪细胞体积,增加棕色脂肪重量,降低血糖,降低血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇酯,同时增加白色脂肪组织中线粒体生成,增加UCP-1等棕色基因表达。 结论: PMQ对HFD小鼠模型具有减肥降糖降脂、“棕色化”白色脂肪组织的作用。 四、五甲基槲皮素的大鼠血浆药代动力学研究 1.HPLC测定方法的建立 实验采取甲醇沉淀蛋白,浓缩后流动相溶解,高效液相色谱检测血浆样品中的PMQ含量,重现性较好,灵敏度较高,结果无干扰,血药浓度在0.1~1.2μg/ml范围内呈现良好线性,最低检测浓度为0.06μg/ml。 2.大鼠尾静脉给药血浆药物时间曲线的研究和药代动力学参数 SD大鼠尾静脉注射给药(i.v.)给予PMQ(12 mg/kg),测定不同时间血浆PMQ浓度,应用DAS药物代谢动力学程序分析药物浓度-时间(C-T)曲线,计算药代动力学参数。结果表明,i.v.给药的C-T曲线符合三室模型,某些药代动力学参数存在性别差异。 3.大鼠灌胃给药血浆药物时间曲线的研究和药代动力学参数 SD大鼠灌胃(i.g.)给予PMQ(20 mg/kg, 50 mg/kg),测定不同时间血浆PMQ浓度,应用DAS药物代谢动力学程序分析药物浓度-时间(C-T)曲线,计算药代动力学参数。结果表明,灌胃给药20 mg/kg ,50 mg/kg的C-T曲线均符合一室模型,生物利用度达到百分之八十九以上,某些药代动力学参数存在性别差异。 第二部分成年小鼠心脏c-kit+细胞研究 目的:c-kit+细胞被认为是成体心脏干细胞的主要表型,本实验分离未分化的小鼠成体心脏c-kit+细胞,并鉴定表型,研究其表达的两种主要电流:容积依赖性氯通道(ICl.vol)和延迟整流性钾通道(IKDR)对细胞增殖的作用。方法:采用细胞免疫荧光和RT-PCR的方法对原代分离及培养的细胞进行鉴定。采用通道阻断剂NPPB/尼氟酸(ICl.vol),4-AP/TEA(IKDR)对c-kit+细胞处理后,用MTT和流式细胞仪的方法研究其对增殖的影响。结果:本实验分离培养得到较纯的c-kit+细胞(96%);ICl.vol与细胞增殖密切相关。结论:容积依赖性氯通道与调控成年小鼠心脏c-kit+细胞的增殖有关。


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