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锌指蛋白Zfx在人脑胶质瘤肿瘤干细胞自我更新和抗凋亡机制研究

饶竞  
【摘要】:第一部分锌指蛋白Zfx在人脑胶质瘤中的表达与意义 目的X染色体耦联锌指蛋白(Zfx)是锌指蛋白超家族中的一员,是胚胎干细胞和成体干细胞自我更新的共同分子基础,Zfx在人脑胶质瘤中的表达及其与人脑胶质瘤的发生和恶性程度的关系有待探讨。 方法收集52例经病理证实的人脑胶质瘤肿瘤标本和8例正常脑组织标本,根据病理结果对人脑胶质瘤标本进行分组,通过实时定量PCR、免疫组织化学和免疫蛋白印迹等方法对标本中Zfx的mRNA和蛋白表达进行检测,应用统计学方法对正常脑组织和不同恶性程度人脑胶质瘤中Zfx的表达进行分析。 结果免疫组化染色结果显示,Zfx主要表达于细胞核。人脑胶质瘤中Zfx的mRNA和蛋白表达表达均高于其在正常脑组织中的表达,在不同病理分级的脑胶质瘤中Zfx的表达水平有差异,Zfx的表达水平随脑胶质瘤的恶性程度增高而增高。 结论Zfx的mRNA和蛋白表达在人脑胶质瘤中异常增高,与人脑胶质瘤的恶性程度呈正相关,它有可能是脑胶质瘤抗凋亡、恶性增殖的一个关键性的调控因子。 第二部分锌指蛋白Zfx在人脑肿瘤干细胞中的表达与意义 目的X染色体耦联锌指蛋白(Zfx)是锌指蛋白超家族中的一员,是胚胎干细胞和成体干细胞自我更新的共同分子基础,Zfx在人脑肿瘤干细胞(BTSCs)中的表达有待探讨。 方法我们从人脑胶质瘤细胞系U251和U87中分选和鉴定脑肿瘤干细胞,通过免疫蛋白印迹法对样本中Zfx的表达进行检测,应用统计学方法对人脑肿瘤干细胞中Zfx的表达进行分析。 结果CD133阳性细胞在人脑胶质瘤中所占比例极其微小:U251约1.97%±0.53%,U87约1.32%±0.34%。CD133阳性细胞在无血清培养基中可以形成肿瘤球,且神经干细胞标志物nestin染色阳性;未分化肿瘤球在完全培养基中分化为肿瘤细胞,并表达与来源胶质瘤细胞相似的神经元标志物β-tubulin和星形细胞标志物神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。未分化肿瘤球中Zfx的蛋白表达水平明显高于其在分化肿瘤球和来源胶质瘤细胞中的表达。 结论Zfx的蛋白表达在人脑肿瘤干细胞中异常增高,它有可能是脑肿瘤干细胞自我更新、抗凋亡的一个关键性的调控因子。 第三部分Zfx基因慢病毒RNA干扰载体构建及有效靶点筛选 目的构建人Zfx基因慢病毒RNA干扰载体,筛选干扰效率最高的有效靶点 方法根据Zfx基因(NM_003410)序列,利用软件设计合成Zfx基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,将干扰片段构建到pFU-GW-iRNA慢病毒载体中,获得Zfx的慢病毒RNA干扰载体。将慢病毒RNA干扰载体转染到人胶质瘤细胞系U251中,转染7天后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,实时定量PCR和免疫蛋白印迹法检测干扰效率。 结果病毒转染效率由荧光显微镜下GFP阳性表达细胞在细胞总数中所占比例表示。转染7天后荧光显微镜观察发现mock和Zfx-RNAi组的病毒转染效率均大于90%。干扰效率则由实时定量PCR和免疫蛋白印迹法检测,实时定量PCR结果显示转染7天后Zfx-RNAi各组中R2组的干扰效率最高,免疫蛋白印迹法证实转染14天后R2组中Zfx蛋白表达明显低于control和mock组。 结论成功构建人Zfx基因慢病毒RNA干扰载体并筛选出干扰效率最高的有效靶点,为进一步研究Zfx在人脑胶质瘤中的作用提供可靠的实验平台和研究基础。 第四部分锌指蛋白Zfx在脑肿瘤干细胞自我更新和抗凋亡机制研究 目的X染色体耦联锌指蛋白(Zfx)是锌指蛋白超家族中的一员,是胚胎干细胞和成体干细胞自我更新的共同分子基础,Zfx在人脑胶质瘤肿瘤干细胞中作用机制有待探讨。 方法我们在胶质瘤细胞系U251和U87中通过慢病毒RNA干扰介导Zfx沉默,免疫磁珠法分选和鉴定脑肿瘤干细胞,通过克隆形成、凋亡流式检测和免疫蛋白印迹等方法探索Zfx在人脑胶质瘤肿瘤干细胞中的功能。 结果我们通过慢病毒介导的RNA干扰技术获得了稳定的Zfx沉默的胶质瘤细胞。我们发现Zfx沉默不但抑制胶质瘤细胞恶性增殖,而且妨碍肿瘤干细胞(BTSCs)的自我更新,还可以通过激活应激相关蛋白转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)及其下游通路诱导细胞凋亡。 结论Zfx可能在脑胶质瘤干细胞的自我更新和抗凋亡机制中起重要作用,它可能是脑胶质瘤抗凋亡、恶性增殖的一个关键性的调控因子。


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