Jagged1介导的Notch信号通路激活诱导大鼠肝移植术后胆管上皮-间质转变的研究

【摘要】：目的:探讨Jagged 1/Notch信号通路诱导的上皮-间质转变在大鼠肝移植术后损伤胆管上皮细胞中的作用研究。 方法:1)96只清洁级、雄性健康SD大鼠随机分成3组,A组;肝移植组(48只),B组;假手术组(24只,开腹肝脏游离,不损伤血管和胆管)和C组;正常对照组(24只)。采用改良Kamada原位“二袖套”法建立大鼠肝移植模型,大鼠随机分成受体组和供体组,受体体重略大于供体体重,供、受体肝动脉结扎,不吻合。分别于术后1d、7d、14d和28d采集静脉血检测总胆红素(TBIL)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、谷丙转氨酶(ALT),同一时间点处死大鼠取肝组织,苏木素-伊红染色(HE)观察三组大鼠肝脏病理学改变,免疫组织化学定位和免疫印迹(western-blot)法检测肝组织Notch信号配体Jagged1、靶基因Hes1,间质细胞标记成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胆管细胞特异性标记角蛋白19片段(CK19)的表达。2)体外分离培养SD大鼠原代肝内胆管上皮细胞(rIBECs),锥虫蓝拒染检测活性、免疫细胞化学(CK19)鉴定细胞。构建pEGFP- IRES2-Jagged 1真核表达载体并Lipofectamine TM2000转染原代肝内胆管上皮细胞,设转染组、转染+Notch信号抑制剂DAPT处理组(剂量为:1μmol/L)、空载体组、未处理组。western-blot法检测四组细胞Jagged 1蛋白、Hes1蛋白,间质细胞标记蛋白(FSP-1,vimentin,α-SMA)和CK19蛋白的表达。倒置显微镜观察四组胆管细胞的形态,transwell小室法检测四组细胞的迁移侵袭能力。 结果:1)成功建立大鼠原位肝移植模型,受体大鼠术后正常条件下喂养存活良好。术后肝功能检测,肝移植组大鼠淤胆明显,TBIL(32.05±3.28μmol/L),γ-GT(118.3±17.4μmol/L)升高显著(P0.05),尤以术后14d升高明显,术后28d出现下降。苏木素-伊红染色(HE)显示肝移植组术后门脉汇管区损伤胆管呈明显的小胆管反应改变;胆管扩张、胆管细胞增生、胆管细胞数量增多、纤维组织增生、门脉汇管区炎性细胞浸润。免疫组化检测:肝移植组术后增生胆管细胞的胞膜及胞浆阳性表达Jagged 1, Hes1,呈棕黄颗粒,且随术后时间延长,棕黄色颗粒颜色加深,对照组Jagged 1, Hes1弱表达于正常胆管,同时弱表达门脉汇管区、肝细胞胞膜以及肝静脉内皮细胞。肝移植组间质细胞标记FSP-1, vimentin,α-SMA均阳性表达于增生显著的胆管细胞,呈棕黄色颗粒,且随术后时间延长,棕黄色颗粒颜色加深,同时增生胆管细胞阴性表达CK19。Western-blot检测:对照组肝组织Jagged 1蛋白、Hes1蛋白低表达,间质细胞标记蛋白(FSP-1, vimentin,α-SMA)低表达,CK19蛋白高表达。术后7d肝移植组Jagged 1, Hes1, FSP-1, vimentin,α-SMA均出现高表达,且随术后时间延长,表达逐渐增强,CK19蛋白表达明显减弱。2)转染Jagged 1载体大鼠肝内胆管上皮细胞Jagged 1蛋白、Hes1蛋白高表达,伴随间质标记蛋白(FSP-1, vimentin,α-SMA)高表达, CK19蛋白低表达,DAPT处理组、空载组和未处理组Jagged 1蛋白、Hes1蛋白低表达,且间质细胞标记蛋白(FSP-1, vimentin,α-SMA)低表达,而CK19蛋白高表达。转染组细胞的形态呈梭形样改变,其余三组细胞为鹅卵石样细胞形态。transwell小室检测细胞迁移侵袭能力发现,转染组迁移细胞(21333±520)与其余三组迁移细胞(2083±381, 2000±661, 1833±389)差异具有显著统计学意义(P0.05)。 结论:改良Kamada原位“二袖套”大鼠肝移植术后早期(≤4w),损伤胆管呈小胆管反应改变,该过程中Jagged 1激活的Notch信号通路,与肝内胆管上皮细胞可能发生的上皮-间质转变密切相关。