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建立组特异性过表达血栓调蛋白的小鼠模型

周千星  
【摘要】:目的 1.构建血栓调节蛋白(TM)表达质粒并分析其在细胞中的生物学活性; 2.建立组织特异性过表达TM的小鼠模型并分析其在动物体内的生物学活性。 方法 1. RT-PCR获取野生型小鼠肺组织中TM基因片段; 2. TOPO表达载体连接TM基因片段,相应质粒转染SVEC细胞后,检测细胞增殖和凋亡,以及蛋白C活化试验; 3. PCCALL2表达载体连接TM基因片段,相应质粒PTMHL与Cre质粒共转染SVEC细胞后,检测TM的表达,以及蛋白C活化试验; 4.显微注射法将构建成功的PTMHL质粒注入供体C57BL/6小鼠受精卵细胞后,采用转基因小鼠的个体组织(鼠尾)中提取基因组DNA进行PCR分析,鉴定基因型; 5.新生PTMHL转基因小鼠与Tie2-Cre小鼠杂交,采用转基因小鼠的个体组织(鼠尾)中提取基因组DNA进行PCR分析,对其TM基因型和Cre基因型鉴定,Western blot和免疫组化法检测组织中TM抗体的表达,用蛋白C活性分析法检测TM转基因小鼠对蛋白C活化的影响。 结果 1.成功构建真核表达TM的质粒,转染SVEC细胞后,细胞的增殖和凋亡得到抑制,细胞中的TM生物活性增强; 2.成功构建组织特异性表达TM的质粒PTMHL,用此质粒和表达Cre质粒共转染SVEC细胞后只有在表达Cre的情况下TM才会过表达,此外细胞中的TM生物活性增强; 3.成功构建组织特异性过表达TM的小鼠模型,同Tie2-Cre小鼠杂交后,新生小鼠的心脏,肾脏,肝脏,肺等组织中内皮细胞的TM表达明显增强,转基因小鼠体内TM的生物活性增加。


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