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亨廷顿蛋白相关蛋白1参与PC12细胞钾离子通道的运输

王丹  
【摘要】:亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin-associated protein 1, HAP1)是最早被发现的能与亨廷顿蛋白(huntingtin,Htt)结合的蛋白质,其与导致遗传性神经退行性疾病亨廷顿病(Huntington’s disease, HD)的突变Htt(mutant huntingtin, mHtt)的结合能力明显强于与正常Htt的结合能力。早期的研究证明,HAP1广泛表达于中枢和周围神经系统,尤以嗅球、下丘脑、脑干、脊髓背角等部位表达水平为高。随后的研究还发现,HAP1不仅表达在神经系统,生殖腺和内分泌系统也存在HAP1。在大鼠内分泌系统中,HAP1选择性表达于腺垂体、甲状腺、肾上腺髓质、胰岛、胃肠道等器官中分泌蛋白质、多肽或单胺类等含氮激素的内分泌细胞中。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞也表达HAP1。HAP1没有跨膜结构域也没有核定位信号,是一种胞质蛋白。 虽然HAP1的功能目前仍不明确,但一系列研究显示,HAP1与神经元内细胞器和分子运输、膜受体转运与再循环有关,尤其在基于微管的胞内运输中具有重要作用。HAP1可通过与驱动蛋白轻链(KLC)和重链(KHC)、动力蛋白激活蛋白(dynactin)复合物的亚单位P150Glued(一种介导动力蛋白激活蛋白与微管及与2种马达蛋白结合的蛋白质)、驱动蛋白家族运动蛋白5 (kinesin family motor protein 5,KIF5)等微管相关运动蛋白的相互作用而参与或调控神经元内囊泡、神经营养因子、受体基于微管的运输。 离子通道是膜上的重要的功能蛋白。离子通道在粗面内质网上合成后通过微管运输到高尔基复合体上加工,然后通过微管运输到细胞膜上。PC12细胞表达电压门控钾离子通道(Kv)、ATP敏感性钾通道(KATP)、钙依赖性钾离子通道(KCa)、内向整流性钾离子通道(Kir)等钾通道,这些钾通道起到稳定静息膜电位、调节动作电位幅值、时程和发生频率、影响囊泡分泌的作用。为了证明HAP1是否参与钾通道从粗面内质网/高尔基复合体向细胞膜的运输,本研究观察了沉默HAP1对PC12细胞膜上钾通道电生理特性和含量的影响。 一、沉默HAP1抑制PC12细胞的延迟整流钾电流 HAP1如果参与钾通道从粗面内质网/高尔基复合体向细胞膜的运输,沉默HAP1后应使细胞膜上的钾通道减少,细胞膜的钾电流也因此而减小。在膜片钳电压钳工作模式下,可在PC12细胞记录到相应的综合电流,包括内向Na+电流、Ca2+电流和外向K+电流,其中Na+电流和Ca2+电流均较小,而钾电流相对较大。在阻断Na+、Ca2+电流条件下,沉默HAP1后PC12细胞的钾电流明显减小。 二、沉默HAP1下调PC12细胞膜上Kv2.1 为了证明沉默HAP1后PC12细胞钾电流的减小是否与钾通道的表达减少有关,我们观察了沉默HAP1对PC12细胞Kv2.1的mRNA表达的影响。在PC12细胞转染HAP1干扰质粒48-72h后,用RT-PCR方法检测显示,电压门控性钾通道亚型Kv2.1 mRNA表达水平不仅没有下调,反而轻度上调,证明沉默HAP1对Kv2.1的表达无抑制作用,因此,沉默HAP1后PC12细胞膜钾电流的减小并非钾离子通道表达减少所致。 为了证明沉默HAP1后PC12细胞膜钾电流的减小与转运到细胞膜上的钾通道减少有关,本研究进一步观察了沉默HAP1对PC12细胞Kv2.1从胞质向细胞膜转运的影响。在PC12细胞共转染HAP1干扰质粒和表达GFP-Kv2.1-HA融合蛋白的质粒后,免疫荧光技术检测显示,胞质内HA免疫反应性增强,而细胞膜上HA免疫反应性明显减弱,表明沉默HAP1可减少Kv2.1从胞质向细胞膜的运输, HAP1参与细胞内Kv2.1向细胞膜的运输。沉默HAP1后Kv2.1 mRNA的上调则可能与转运至膜上的Kv2.1减少而使其表达代偿性增加有关。


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