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PTD4-VP3融合蛋白包涵体复性的初步探究

张雅婷  
【摘要】:VP3蛋白(亦称Apoptin)是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的一个小分子蛋白质。研究表明,Apoptin能选择性地诱导人转化细胞和肿瘤细胞发生凋亡,而对正常二倍体细胞无作用,是一种理想的抗肿瘤药物。本实验室前期的研究成功构建了PTD4-VP3融合蛋白的原核表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统诱导表达后获得了PTD4-VP3融合蛋白。但实验发现,该蛋白大量以无活性的包涵体形式存在。而可溶性表达量却很低。本实验尝试将PTD4-VP3融合蛋白包涵体复性,然后用MTT法和流式细胞术检测复性后蛋白的生物学活性。为PTD4-VP3的大量制备提供新的思路。 将含重组质粒pET-28a-PTD4-VP3的表达菌株E.coli BL21 (DE3)PlysS接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中诱导表达,将获得的融合蛋白包涵体溶解于8M尿素中过夜。用亲和层析的方法,将溶解的包涵体过镍柱纯化。再将纯化后的包涵体置于透析袋中,在梯度浓度的尿素复性液中缓慢复性。用SDS-PAGE和BCA蛋白定量检测包涵体的纯度和浓度。MTT法检测复性后包涵体抑制肿瘤细胞增殖的效果。流式细胞术观察复性后包涵体对肿瘤细胞的凋亡率。 SDS-PAGE显示,在上样量相等的条件下,包涵体的条带深度明显高于可溶性表达,蛋白BCA定量后,发现从1L E.coli菌液中可得到高达8.5±0.7mg的PTD4-VP3包涵体。而仅仅只能得到0.7±0.3mg的PTD4-VP3可溶性表达。MTT法显示:在25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml,100μg/ml四个蛋白浓度点,PTD4-VP3融合蛋白复性后包涵体对人源宫颈癌Hela细胞增殖的抑制率分别为40±2.1%、70±2.2%、71±2.4%和91±2.9%。PTD4-VP3可溶性表达的抑制率分别为20±1.7%、32±1.9%、50±2.5%和58±2.8%。流式结果显示:在5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,25μg/ml四个蛋白浓度点,复性后包涵体诱导Hela细胞的凋亡率分别为40.5±2,8%、63.1±3.6%、62.3±4.5%、61.4±3.8%。可溶性表达组的凋亡率分别为41.8±2.2%、60.3±3.2%、64.6±3.8%、59.8±4.5%。由此可看出,因此本实验成功复性了PTD4-VP3蛋白,蛋白的活性完全得到恢复。这种从包涵体中复性PTD4-VP3融合蛋白的方法为PTD4-VP3的大量制备提供了的新的思路。


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