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基于纳米金探针的全氟化合物生物检测技术研究

王春香  
【摘要】:近年来,全氟化合物(Perfluorinated compounds, PFCs)在工业生产和生活消费领域中应用越来越广,由此产生的环境污染问题日趋严重。其中,全氟辛烷磺酰基化合物(Perfluorooctane sulfonates, PFOS)和全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid, PFOA)是环境中最典型、污染最重的,也是多种其他PFCs在环境中的最终代谢产物。鉴于PFCs的健康危害性,近年来欧美发达国家已发出一系列的关于PFOS、PFOA等的销售及使用限令。当前PFOS已在相关出口产品中被广泛限制,成为继二恶英之后的又一绿色壁垒。加强对PFCs的检测是控制这些污染物及防治其健康危害的基础和必需手段,对我国环境保护、居民健康和国民经济发展具有重要意义。 到目前为止,PFCs的检测方法主要是化学分析法,如色谱法。但色谱法检测过程复杂、检测周期长、费用高,适用于要求精确定量的场合。理想的PFCs检测程序应该是先利用一种简便的方法对待检样品进行初步的筛选,如果PFCs超过规定的标准,再利用色谱法检测具体的PFCs。因此,急需建立一种简便、快速、经济且易于实施的检测PFCs的新方法,以适应大规模样本筛查及长期环境监测的需求。 本研究根据PFCs与PPARα核受体相互作用形成的配体-PPARα/RXR复合物能与PPARα反应元件(PPARαresponse element, PPRE)核酸序列特异性结合的特性,利用纳米金探针以及银染增强技术的高灵敏度,借鉴配体受体相互作用和转录因子结合顺式反应元件的思路,将二者结合起来,建立一套全新的微量PFCs的快速分析方法,称为结合银染增强的纳米金-PPRE探针生物检测法,简称纳米金-PPRE探针法。 第一部分建立纳米金-PPRE探针法检测体系 目的:本部分旨在建立一种新的鉴定PFCs并进行定量研究的生物检测方法——纳米金-PPRE探针法,能作为大量样本的预筛手段,可广泛用于基层实验室。方法:本研究基于PFCs与PPARα特异结合的这一特性,利用纳米金探针银染增强技术的高灵敏度,建立一套全新的微量PFCs的快速分析方法。以最具代表性的PFOS作为研究对象,通过固定anti-PPARα抗体于微孔板上,用PFOS激活PPARα受体形成PFOS-PPARα/RXR复合体,并加入到微孔板中,然后加入纳米金-PPRE探针进行检测;通过检测与PFOS激活的PPARα结合的PPRE-纳米金颗粒并被银染增强液增强后的信号来定量检测PFOS。绘制PFOS浓度与OD值之间的剂量-效应关系曲线。本部分研究对实验条件进行了优化,并与标准分析方法高效气相色谱-质谱联用技术(HPLC/MS)进行了比较,以及利用该方法检测了其他的PFCs,如PFOA。结果:(Ⅰ)通过Western blot方法检测肝细胞核提取产物,验证了核提取产物中PPARα蛋白的提取效果良好;(Ⅱ)建立时间-剂量-反应曲线,确定最佳银染增强显色时间为3min;(Ⅲ)定量研究可得到PFOS剂量-效应关系曲线,在一定范围内(100 pM-1μM)PFOS诱导产生效应(OD值)与PFOS浓度之间呈良好的线性相关(R2=0.9582),EC50约为10nM,最低检测限为10 pM;(Ⅳ)检测结果与HPLC/MS比较具有良好的一致性;(ⅴ)利用该方法检测了其他的PFCs也取得了良好的结果。结论:纳米金-PPRE探针法具有灵敏、快速、经济、简便的特点,仪器设备方便易操作,结果与HPLC/MS具有可比性,是一种新颖而实用的检测PFCs的生物分析方法。 第二部分纳米金-PPRE探针法检测环境和生物样本中的全氟化合物 目的:利用纳米金-PPRE探针法定性和定量检测环境水样和血清生物样本中的PFCs。方法:将采集的水样和生物样本分别经过一定的前处理过程后,溶于DMSO,然后以PFOS为标准物质采用纳米金-PPRE探针法检测制定标准曲线,并同时用纳米金-PPRE探针法检测样本中PFCs所产生的效应,从标准曲线中查出各组检测样本中相当的PFCs的相对含量。检测结果与HPLC/MS检测结果相比较,并分析其差异原因。本部分同时进行了一系列质量控制和质量保证研究,包括回收率、精密度、准确性、检测限、线性范围等。结果:结果表明纳米金-PPRE探针法准确性、精密度和回收率均较好,检测限低于HPLC/MS法,检测线性范围较宽,基本达到了生物检测技术质量控制的要求;对环境水样的检测结果比HPLC/MS检测结果稍高,但在同一个数量级上,其差异可能是由于一些干扰物质造成的;血清样本的检测结果与HPLC/MS法基本一致。结论:结合有效的前处理过程,纳米金-PPRE探针法可以快速地用于实际样本的定性与定量检测,结果与标准化学分析方法具有可比性。 总而言之,纳米金-PPRE探针法是一种颇具前景的有效的PFCs生物检测方法,与标准分析法基本一致的检测结果以及其灵敏、快速和经济的特点使它可以作为大量污染站点的预筛手段。纳米金-PPRE探针法既能良好的评价综合效应又能进行方便的现场操作,勿需细胞培养和同位素标记,简便易行,检测时间短,灵敏度高,可广泛用于环境和生物样本的PFCs分析,既可独立使用也可做为色谱分析的预筛辅助手段,在一般实验室皆可开展,特别适用于基层单位进行PFCs样本的筛选。因此,本研究建立PFCs的快速生物检测方法将为这类污染物的监测提供有力手段,同时也能为环境污染的生态和人群健康风险评价提供有价值的信息,具有重要的理论意义和实际应用价值。


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