收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

α_1Na,K-ATPase和PDCD5在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及其与AHL的关系

王燕  
【摘要】:第一部分成年小鼠耳蜗血管纹缘细胞的原代分离培养及鉴定 目的:建立成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞(marginal cell, MC)的体外培养及鉴定方法,为进一步研究成年期MC的生理功能提供实验细胞。 方法:显微分离成年期小鼠耳蜗血管纹组织,以Ⅱ型胶原酶消化原代培养边缘细胞,将其接种于六孔板中贴壁生长,加入含有15%胎牛血清、表皮生长因子、氢化可的松、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸等促进细胞生长的完全培养基,在5%CO2/95%空气的37℃恒温培养箱中培养,每天观察细胞生长情况,换液一周两次或培养基颜色变浑浊。倒置显微镜下观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)法测细胞的生长曲线,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫荧光法检测上皮细胞的标志物-中间丝角蛋白18(CK18)和耳蜗血管纹的独特标志物KCNQ1的表达,RT-PCR检测CK18和KCNQ1mRNA的表达。 结果:倒置显微镜下可见接种24-48h后细胞贴壁增殖,形成大小不等的细胞岛,一周后,细胞迅速生长,相互融合,紧密连接,形成单层极性上皮层,呈典型的“铺路石”样外观。透射电镜观察可见多角形细胞表面有较多微绒毛,胞浆内线粒体、内质网等细胞器丰富。免疫荧光细胞化学技术检测显示CK18和KCNQ1蛋白表达阳性,RT-PCR结果示CK18和KCNQ1的mRNA均有表达。 结论:采用原代消化培养技术,成功建立成年小鼠耳蜗血管纹MC的体外原代培养,为进一步研究成年期MC的功能和某些内耳疾病的发病机制提供了实验细胞基础。 第二部分α1Na,K-ATPase通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及其与AHL的关系 目的:研究α1Na, K-ATPase离子转运蛋白在不同年龄段C57BL/6J(C57)小鼠耳蜗血管纹的表达及其意义。 方法:选择3M,6M,9M,12M月龄C57J小鼠各12只,采用听性脑干反应(Auditory Brainstem Response, ABR)分别检测其听力变化。采用免疫组织荧光法和免疫印迹杂交Western blot (WB)检测α1Na,K-ATPase蛋白在小鼠耳蜗的表达变化,逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测各年龄段小鼠耳蜗α1Na,K-ATPase mRNA在不同鼠龄小鼠耳蜗中的表达水平。 结果:随着鼠龄的增长,C57小鼠各频率ABR闽值逐渐升高,自6月龄小鼠的ABR反应闽逐渐增加,其数值与低龄组小鼠相比其差异均具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光检测显示α1Na,K-ATPase主要分布于血管纹底侧膜和螺旋韧带,表达量也随着鼠龄的增加呈现减少的趋势,Real-Time PCR检测显示α1Na,K-ATPase mRNA随着小鼠年龄的增长其表达逐渐下调,与其蛋白变化趋势相一致。 结论:C57小鼠耳蜗α1Na,K-ATPase的表达随着年龄的增加而逐渐下降,可能与年龄相关性听力损失具有一定联系。 第三部分α1Na,K-ATPas通道蛋白在成年C57BL/6J小鼠血管纹边缘细胞的表达和意义 目的:初步研究α1Na,K-ATPase在血管纹缘细胞的表达和意义,为进一步探索耳蜗K+循环提供实验研究基础。 方法:采用胶原酶消化法体外分离培养成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞。采用免疫组织荧光法检测α1Na,K-ATPase在血管纹边缘细胞的表达和分布,并运用RT-PCR检测α1Na,K-ATPase mRNA在边缘细胞的表达情况。 结果:体外成功培养和纯化了血管纹边缘细胞,免疫荧光检测可见有α1Na,K-ATPase阳性表达,主要位于细胞膜,RT-PCR也检测到α1Na,K-ATPase mRNA的表达。 结论:α1Na,K-ATPase在血管纹缘细胞表达,可能参与了耳蜗K+循环形成,在维持正常耳蜗听力中起重要作用。 第四部分凋亡相关蛋白PDCD5在C57BL/6J小鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的年龄相关性表达及与老年性的关系 目的:研究PDCD5和caspase-3在不同年龄段C57BL/6J(C57)小鼠耳蜗毛细胞、血管纹及螺旋神经节细胞的表达,初步探讨其在年龄相关性听力下降发生、发展中的作用。 方法:选择C57小鼠3M,6M,9M,12M月龄段各15只,分为四组。对各组小鼠双侧click、6、8 kHz ABR阈值检测。采用免疫组织化学法和Western blotting(WB)检测各月龄段小鼠耳蜗PDCD5和caspase-3蛋白的表达,实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测各月龄段小鼠耳蜗PDCD5和Caspase-3基因mRNA的表达变化。 结果:随着年龄的增长,C57小鼠各频率ABR阈值逐渐提高,耳蜗PDCD5和caspase-3蛋白的表达亦逐渐增强。3月龄和6月龄小鼠耳蜗毛细胞和血管纹细胞及螺旋神经节细胞仅出现少量PDCD5和caspase-3蛋白表达,9月龄时表达有明显增加,至12月龄时表达最强,各组间相比有显著性差异(P0.05)。Real-Time PCR检测显示PDCD5和Caspase-3基因mRNA随着小鼠年龄的增长其表达逐渐增强,与其蛋白变化趋势相一致。 结论:C57小鼠耳蜗PDCD5和caspase-3的表达随着年龄的增长而明显增高,说明参与了小鼠耳蜗毛细胞和血管纹细胞及螺旋神经节细胞的凋亡调控过程,与耳蜗的老化密切相关,可能是老年性聋发病机制中的一个重要因素。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 唐玥玓;耳蜗内淋巴环境阳离子成分稳态的研究进展[J];听力学及言语疾病杂志;2003年01期
2 陈浮;苏纪平;;耳蜗血管纹内皮细胞的机械敏感性离子通道[J];新乡医学院学报;2007年02期
3 王爱梅,汤浩,姜恩魁,高东明,焦金菊,周丰;丹参注射液拮抗庆大霉素耳蜗毒性的实验研究[J];锦州医学院学报;2003年01期
4 吴翊钦;钟秀容;陈文列;陈莲云;;豚鼠耳蜗血管纹和前庭膜的超微结构[J];福建医科大学学报;1990年02期
5 王爱梅,姜恩魁,高东明,焦金菊,周丰;一氧化氮合酶异构体在豚鼠耳蜗的定位表达[J];锦州医学院学报;2004年01期
6 崔江,汪吉宝;豚鼠耳蜗微血管的形态学观察[J];临床耳鼻咽喉科杂志;1995年02期
7 林琳,孙建和,黄德亮,朱光明,侯宁;胎儿耳蜗血管纹的扫描电镜观察[J];临床耳鼻咽喉科杂志;2005年04期
8 杨阳;孔维佳;;pEGFP-N1/MnSOD重组质粒的构建及体外表达[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2007年22期
9 陈敏;孔维佳;;边缘细胞AQP1和AQP2表达的初步研究[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2009年04期
10 吴振恭;褚汉启;黄孝文;崔永华;;Na-K-2Cl联合转运子1在小鼠耳蜗侧壁组织中的表达及意义[J];听力学及言语疾病杂志;2007年01期
11 罗蓉;孔维佳;程华茂;;线粒体毒素诱导突发性耳聋模型血管纹损伤机制的研究[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2009年02期
12 韩芳;褚汉启;熊浩;王燕;周良强;陈金;崔永华;;新生小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养及鉴定[J];华中科技大学学报(医学版);2010年05期
13 张鹏志;陈俊;薛涛;曹增玉;邱建华;;大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及心钠素的表达[J];中华耳科学杂志;2008年03期
14 钟时勋,刘兆华;杂色和白色豚鼠听反应阈及耳蜗血管纹细胞增殖活性的差异[J];听力学及言语疾病杂志;2000年04期
15 王爱梅,汤浩,沈静,崔桂英,崔城;丹参注射液对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗血管纹NOS活性的影响[J];中国应用生理学杂志;2001年01期
16 石丽娟,汤浩;丹参注射液对链霉素耳中毒豚鼠耳蜗iNOS表达的影响[J];中国应用生理学杂志;2005年01期
17 吴展元,张志坚;低供氧对清醒豚鼠耳蜗功能的影响[J];中华耳鼻咽喉科杂志;1994年03期
18 谭颖徽,成晋川,李忠禹,赖西南,刘荫秋,周树夏;颌面部高速投射伤致耳蜗损伤的电镜观察[J];口腔医学;1994年02期
19 沈静,汤浩,方秀斌,张合,章晓芳,张铁民;豚鼠耳蜗一氧化氮合酶组织化学反应的定量观察[J];解剖科学进展;1999年01期
20 刘斌;任基浩;葛益林;;豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤时IκBα的表达[J];中国耳鼻咽喉颅底外科杂志;2010年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨琨;黄治物;黄娟;章晓军;肖伯奎;;急慢性水杨酸钠注射对大鼠耳蜗Na-K-2CL协同转运体家族mRNA表达的影响[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编(下)[C];2007年
2 陶明德;吴云岗;张天宇;戴培东;;耳蜗中基底膜振动的研究[A];第七届全国水动力学学术会议暨第十九届全国水动力学研讨会文集(上册)[C];2005年
3 付勇;丁大连;Richard Salvi;;大鼠耳蜗切片听神经纤维及螺旋神经节细胞的定量观察[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
4 牛蔚林;黄尔联;齐彬;;耳蜗中黏性流体的速度分布和压力斜度分布[A];中国力学学会学术大会'2005论文摘要集(上)[C];2005年
5 赵晶;孙建军;;卡波金对豚鼠噪声损伤的改善及耳蜗微循环的观察[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编(下)[C];2007年
6 周义德;丁大连;郑宏良;郑桂亮;张青;Richad J Salvi;;经圆窗膜应用卡铂对灰鼠耳蜗结构和功能的影响[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
7 徐琳;高下;陈杰;朱光洁;麻晓峰;丁小琼;陆玲;;Ad-Hath1-DsRed2,Ad-DsRed2重组腺病毒的构建及小鼠耳蜗圆窗径路基因导入的实验研究[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
8 刘元法;;64层VCT对耳蜗硬化症的重建成像探讨[A];2010中华医学会影像技术分会第十八次全国学术大会论文集[C];2010年
9 李荣峰;蔡妙珍;刘鹏;徐根娣;梁和;;大豆根边缘细胞对铝毒的响应及机理研究[A];2006年中国植物逆境生理生态与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
10 马伯军;傅昭娟;龚春风;潘建伟;朱睦元;;大豆根边缘细胞发育的生物学特性研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王燕;α_1Na,K-ATPase和PDCD5在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及其与AHL的关系[D];华中科技大学;2011年
2 杨阳;MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护[D];华中科技大学;2008年
3 俞亦龄;Rb基因在调控耳蜗支持细胞增殖中的作用及机制[D];复旦大学;2010年
4 张欣欣;活性氧对耳蜗损伤的分子机制研究[D];军医进修学院;2001年
5 刘得龙;大鼠耳蜗及下丘GABA_A受体生后表达规律的实验研究[D];吉林大学;2004年
6 汪芹;增龄相关听力损失及卡那霉素致聋大鼠耳蜗TMPRSS3、ENaC-α基因表达的初步研究[D];中南大学;2010年
7 王苹;腺病毒介导的神经营养因子和Calpastatin对大鼠耳蜗神经元退化的保护作用[D];吉林大学;2004年
8 黑任轶;microRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用探讨[D];第四军医大学;2011年
9 何亚;耳蜗雪旺细胞来源的Wnt1对耳蜗移植干细胞分化的影响及其分子机制研究[D];第四军医大学;2012年
10 申卫东;大鼠耳蜗α_(1D) L—型电压门控性钙通道蛋白组织特异性异构体的鉴定及在HEK293细胞系中的表达[D];中国人民解放军军医进修学院;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谢利红;豚鼠耳蜗血管纹萎缩与内淋巴电位的关系[D];广西医科大学;2004年
2 穆恩;水杨酸钠对细菌内毒素引起的大鼠耳蜗诱导型一氧化氮合酶表达的影响[D];中国医科大学;2003年
3 陈静;γ-氨基丁酸在正常发育期小鼠耳蜗的分布[D];昆明医学院;2005年
4 席恺;α-硫辛酸对豚鼠椎基底动脉缺血-再灌注听力损伤的保护作用[D];郑州大学;2002年
5 宋巍;大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
6 罗伟;稳态噪声性听神经元损伤蜗内AD-NT3基因治疗的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年
7 赵慕兰;葛根素注射液拮抗庆大霉素耳蜗毒性的实验研究[D];中国医科大学;2005年
8 焦彦超;碟脉灵治疗老年性耳聋的实验性研究[D];吉林大学;2005年
9 袁波;α-硫辛酸对庆大霉素所致大鼠耳毒性损害的保护作用[D];中国医科大学;2005年
10 张静;客观听功能测试对听力正常耳鸣机制的研究[D];天津医科大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 程莉;早装耳蜗早受益[N];健康报;2001年
2 本报记者 赵绍华;耳蜗术后重康复[N];健康时报;2003年
3 ;我有人工耳蜗了[N];北京日报;2002年
4 钱铮;人体长有“活电池”,就在耳蜗里[N];新华每日电讯;2008年
5 记者  毛黎;敏锐听力得益于螺旋状耳蜗[N];科技日报;2006年
6 施乾元;人工耳蜗 盼你怵你为哪般[N];中国消费者报;2003年
7 张洪军;耳鸣与哪些疾病有关[N];健康报;2003年
8 蒋肖男;警惕药物性耳聋[N];中国医药报;2006年
9 记者储国强;后天耳聋者可用牙齿“听”声音[N];科技日报;2002年
10 赵广兰;如何防止老态龙钟(待续)[N];大众卫生报;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978