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集胞藻藻胆蛋白降解的蛋白酶研究

刁红丽  
【摘要】:在各种营养缺乏的情况下,藻胆体的降解会引起蓝藻细胞的颜色由正常的蓝绿色转变成黄绿色,这种现象被称为“褪色”或“光漂白”。虽然已有研究表明NblA与藻胆体的降解密切相关,但是对于NblA引发藻胆体降解的详细机制并不清楚。藻胆体的降解过程除了需要NblA的引发之外必定需要特异性降解藻胆体的蛋白酶。Deg家族蛋白酶(HhoA、HhoB、HtrA)和CtpA蛋白酶均是蓝藻细胞中非常重要的蛋白酶,目前国际上对于这些蛋白酶与藻胆体降解机制之间的关系尚不清楚,本论文通过体外蛋白酶活性试验和复合物试验,重点对Deg和CtpA蛋白酶与藻胆蛋白降解机制之间的关系进行了研究,具有重要的理论意义和创新价值。 文中首次对集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803中的Deg和CtpA蛋白酶进行了克隆表达。在切除N端信号肽或跨膜结构之后,携带组氨酸标签的成熟HhoA、HhoB、HtrA和CtpA融合蛋白在大肠杆菌中得以表达,利用镍离子亲和层析法获得了提纯后的蛋白酶。 分别采用酪蛋白、牛血清蛋白、体内重组色素蛋白和天然藻蓝蛋白作为底物进行酶活性体外测试。结果表明HhoA和HtrA对酪蛋白、重组色素蛋白和天然藻蓝蛋白均具有水解活性,这证实了HhoA和HtrA能够体外降解藻胆蛋白,与藻胆体降解机制密切相关。HhoB对被测试的所有底物均没有活性,显示了其功能与HhoA和HtrA之间的差异,但并不能仅凭体外活性试验就完全排除HhoB在藻胆体降解过程中的作用。荧光定量PCR研究表明,缺氮培养后藻细胞中的hhoB转录量剧增,明显超过hhoA和htrA,这表明HhoB有可能在藻胆体降解机制中发挥作用,故推测其酶活性有可能需要某种未知的多肽或辅助因子的激活。CtpA对酪蛋白和重组色素蛋白显示极低活性,但是对天然藻胆蛋白没有降解作用,同时ctpA在缺氮不同时段相对表达量变化不显著,故推测其与藻胆体的降解过程无关。 文中将集胞藻PCC 6803中的两个nblA基因以融合蛋白的方式在大肠杆菌中进行表达获得NblA蛋白,同时利用大肠杆菌表达获得鱼腥藻PCC 7120中的NblB蛋白,研究了添加NblA、NblB、金属离子Mg2+和Ca2+对蛋白酶活性的影响。结果显示,NblA和NblB对蛋白酶活性无促进作用,反而有抑制作用,这表明HhoA和HtrA在藻胆体降解过程中的水解作用是独立于NblA和NblB的。研究结果还显示两种金属离子对酶活性基本没有影响,并无促进作用。 通过体外复合物研究可以确认HhoA.HhoB、HtrA和CtpA四种蛋白酶与CpcA、NblA和NblB之间未能形成复合物,由此可以确认,NblA造成的酶活性抑制来自NblA与藻胆蛋白亚基之间形成的复合物,并非其与蛋白酶之间形成的复合物。HhoA与缺氮培养藻上清中的藻胆蛋白也不能形成复合物,故推测在HhoA与藻胆蛋白的降解作用中必然存在某种辅助因子的作用,但是该辅助因子并非Nb1A和Nb1B。 最后通过荧光定量PCR实验分析集胞藻中13个蛋白酶基因在缺氮培养不同时段表达量的变化,根据试验结果推测pepP与藻胆体降解的早期启动有密切关系,hhoB、htrA、ftsH、sppA和hhoA这5个基因可能在藻胆体降解的中后期发挥作用,其余7个基因clpP、ape2、sll2008、ctpA、ymxG、gcP、clpB可能与藻胆体的降解过程无关。 本论文还包括另外两个研究内容,一是对蓝藻藻胆体核-膜连接蛋白ApcE缺失突变体的体外自催化重组研究,构建鱼腥藻Anabaena. sp PCC 7120别藻蓝蛋白ApcE(1-240)的一系列N端缺失突变体基因,在大肠杆菌中进行高效表达,对脱辅基蛋白与藻蓝胆素(PCB)的体外自催化重组进行了研究,结果表明:在含有4 mol/L尿素的磷酸钾缓冲体系中,ApcE(25-240)脱辅基蛋白可与藻蓝胆素体外重组实现共价连接,其余6个缺失突变体蛋白仅能与藻蓝胆素进行非共价连接,不能发生自催化重组。 二是集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白各亚基的体内生物合成研究,利用多质粒组合进行体内重组,将apcA、apcB、cpcA和cpcB对应的脱辅基蛋白分别与裂合酶CpeS、CpcE/F或CpeT以及血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达,从而得到具有光学活性的色素蛋白PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-CpcA(?)口PCB-CpcB,实现藻胆蛋白亚基的体内生物合成。关键词:蛋白酶藻胆蛋白藻胆体降解重组色素蛋白体外重组体内重组


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