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甲基化寡核苷酸诱导灭活EDNRB基因在先天性巨结肠发病机制中的研究

张万里  
【摘要】:第一部分甲基化寡核苷酸诱导灭活小鼠胚胎干细胞EDNRB基因 目的:先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)是新生儿最常见的肠道畸形之发病因素包括遗传因素和环境因素。EDNRB/EDN3/ECE1信号传导通路的异常是HD重要发病机制,但该信号传导通路相关基因突变不能解释全部HD患者病因,HD中EDNRB基因突变率仅3%左右。本研究旨在设计合成特异性甲基化寡核苷酸诱导灭活EDNRB基因,探讨EDNRB基因甲基化与HD发病机制的关系。 方法:在Genbank和DBTSS数据库检索小鼠EDNRB基因序列及启动子序列,根据甲基化寡核苷酸设计原理设计与EDNRB基因启动子互补甲基化寡核苷酸,在5’端标记FITC,采用Effectine将寡核苷酸转染至C57BL/6小鼠胚胎干细胞,采用流式细胞分选仪分选FITC阳性细胞,并将1μM 5-Aza-dC处理转染后C57BL/6小鼠胚胎干细胞,采用重亚硫酸盐测序法(BSP)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测转染前后及5-Aza-dC处理后C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子甲基化状态及mRNA和蛋白质表达改变。 结果:C57BL/6小鼠EDNRB基因启动子1008~2889bp为CpG岛:A%:23.22,T%:23.65,C%:25.13,G%:28.00,C+G%:53.13,CpG%:4.20,A+T/C+G%:0.88。采用Effectine转染寡核苷酸至C57BL/6小鼠胚胎干细胞效率为40.2%。MON1与BSP扩增产物第3、4、5CG位点对应;MON1转染前,C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子1~16CG位点甲基化率均为0.0%;转染MON1后BSP测序示1~2CG位点和6~16CG位点甲基化率分别为30%、40%、50%、40%、40%、40%、40%、40%、40%、30%、20%、20%和10%,MON1对应的BSP扩增产物3、4、5CG位点甲基化率分别为60%、60%和60%;5-Aza-dC处理后,C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子1~16CG位点甲基化率均为0.0%。MON2对应BSP扩增产物9、10、11CG位点;MON2转染前,EDNRB基因1~16CG位点甲基化率均为0.0%;转染后1~8CG位点和12~16CG位点甲基化率分别为20%、30%、40%、40%、50%、40%、50%、60%、70%、60%、40%、40%和30%,MON2对应9、10、11CG位点甲基化率为70%;5-Aza-dC处理后,C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子1~16CG位点甲基化率均为0.0%。MON3对应BSP扩增产物13、14、15CG位点,转染前,互补EDNRB基因启动子1~20CG位点甲基化率均为0.0%;转染后1~12CG位点、16~20CG甲基化率分别为10%、10%、30%、30%、30%、40%、50%、50%、50%、60%、60%、60%、60%、60%、50%、30%和10%,MON3对应13、14、15CG位点甲基化率为70%;5-Aza-dC处理后,C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子1~20CG位点甲基化率均为0.0%。MON4对应BSP扩增产物第2、3、4、5CG位点;转染前对应EDNRB基因1~8CG位点甲基化率均为0.0%;转染后,第1CG位点、MON4对应2、3、4、5CG位点和6~8CG和甲基化率为分别为10%、20%、20%、20%、20%、10%、10%和0%;5-Aza-dC处理后,EDNRB基因启动子1~8CG位点甲基化率均为0.0%。CON1与MON2除mCG外碱基序列一致,CONl转染前、转染后及5-Aza-dC处理后C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子1~16CG位点甲基化率均为0.0%。CON2与MON2除首尾外碱基序列一致,CON2转染前、转染后及5-Aza-dC处理后EDNRB基因启动子1~16CG位点甲基化率均为0.0%。转染前MON1、MON2, MON3、MON4、CON1和CON2 C57BL/6 mESC细胞EDNRB/GAPDH无明显差异(均P0.05);转染后,MON1、MON2、MON3转染的C57BL/6 mESC细胞EDNRB/GAPDH较转染前显著降低(均P0.05);转染MON4、CON1和CON2的C57BL/6 mESC细胞EDNRB/GAPDH较转染前无明显差异(均P0.05);5-Aza-dC处理后,转染MON1、MON2、MON3的细胞EDNRB/GAPDH较作用前显著升高(均P0.05),处理后MON4、CON1和CON2细胞的EDNRB/GAPDH无明显差异(均P0.05)。MON4、CON1和CON2转染后EDNRB蛋白质表达水平与正常未转染细胞无明显差异(P0.05),甲基化寡核苷酸MON1、MON2和MON3转染后C57BL6/J mESC细胞EDNRB蛋白质表达水平显著低于正常未转染细胞和寡核苷酸MON4、CON1及CON2转染细胞(均P0.05);转染MON3甲基化寡核苷酸后C57BL6/J mESC细胞EDNRB蛋白质表达水平显著低转染甲基化寡核苷酸MON1和MON2的C57BL6/J mESC细胞(均P0.05);转染甲基化寡核苷酸MON2后EDNRB蛋白质表达水平低于转染甲基化寡核苷酸MON1细胞,但差异无统计学意义(P0.05)。5-Aza-dC作用后,转染MON1、MON2、MON3、MON4、CON1和CON2的C57BL6/J mESC细胞与未转染细胞EDNRB蛋白质表达无明显差异。 结论:特异互补甲基化寡核苷酸可诱导EDNRB基因启动子产生甲基化,其诱导产生甲基化及抑制基因表达能力与甲基化寡核苷酸靶向EDNRB基因启动子位置有关。 第二部分甲基化寡核苷酸诱导EDNRB基因启动子甲基化的遗传 目的:甲基化作为表观遗传学最重要的调控机制,具有遗传稳定性特点,可在代代间、细胞周期中稳定遗传。在细胞有丝分裂DNA半保留复制时,甲基化双链解链形成复制叉样模板,作为半甲基化底物在DNMT1催化下CG变成mCG,这种半保留复制机制使甲基化在细胞分裂中得到有效遗传。本研究设计特异性针对EDNRB基因启动子甲基化寡核苷酸诱导其产生甲基化,检测不同培养代数时EDNRB基因启动子甲基化状态,探讨甲基化寡核苷酸诱导EDNRB基因启动子产生的甲基化的遗传性。 方法:在Genbank和DBTSS数据库检索小鼠EDNRB基因序列及启动子序列,根据甲基化寡核苷酸设计原理设计与EDNRB基因启动子互补甲基化寡核苷酸,在5’端标记FITC,采用Effectine将寡核苷酸转染至C57BL/6小鼠胚胎干细胞,采用流式细胞分选仪分选FITC阳性细胞并连续培养,采用重亚硫酸盐测序法(BSP)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测转染前后及培养不同代数时C57BL/6小鼠胚胎干细胞EDNRB基因启动子甲基化状态及mRNA和蛋白质表达改变。 结果:MON1、MON2、MON3和MON4转染后互补EDNRB基因启动子对应CG位点甲基化率分别由0%、0%、0%和0%增加到60%、70%、70%和20%,转染CON1和CON2前及转染后互补EDNRB基因启动子对应CG甲基化率均为0%;MON1、MON2、MON3和MON4互补EDNRB基因启动子对应CG位点甲基化率随着培养代数增加而下降,MON1、MON2和MON3转染后培养6代时互补EDNRB基因启动子对应CG位点甲基化率下降至0%;MON4转染后培养3代互补EDNRB基因启动子对应CG位点甲基化率下降至0%。MON1、MON2和MON3转染后EDNRB基因(?)nRNA和蛋白质显著降低,MON4、CON1和CON2转染后较转染前无明显改变;将转染细胞培养,MON1、MON2、MON3和MON4甲基化寡核苷酸转染的EDNRB基因mRNA和蛋白质表达随培养代数的增加而增加,MON1、MON2、MON3在转染培养6代时EDNRB基因mRNA和蛋白质表达增加至转染前水平;MON4在转染培养3代时EDNRB基因mRNA和蛋白质表达增加至转染前水平;CON1和CON2转染前后EDNRB基因mRNA表达无明显改变。 结论:甲基化寡核苷酸诱导EDNRB基因启动子产生的甲基化不具有稳定的遗传性,随着培养代数增加,EDNRB基因启动子甲基化逐渐消失,抑制的mRNA和蛋白质表达逐渐恢复。通过甲基化寡核苷酸诱导灭活EDNRB基因途径无法建立先天性巨结肠模型。


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