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穿心莲内酯诱导人类风湿关节炎纤维细胞样滑膜细胞凋亡和细胞周期停滞作用的研究

闫杰  
【摘要】:[背景] 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis)是一种自身免疫性疾病,病理上以滑膜增生和软骨降解为特征,滑膜的前端以血管翳进行性侵袭和破坏骨关节,这种血管翳中主要由纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)组成,同时伴有大量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润。在类风湿关节炎病人中,这种纤维细胞样滑膜细胞的侵袭是破坏骨关节的主要因素。我们认为,如果有办法抑制纤维细胞样滑膜细胞的生长,则可以对类风湿关节炎病人的病情缓解起到一定的作用。 穿心莲(Andrographis paniculata)是爵床科穿心莲属植物,穿心莲内酯(Andrographolide)是中药穿心莲的主要活性成分,它是一种二萜类内酯类化合物,具有清热解毒,凉血消肿的功效。基础研究和临床领域的多项研究证明,穿心莲内酯有多种功效,如免疫调节、抗菌、抗炎、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病等。以往的研究中也有穿心莲内酯诱导细胞凋亡和降低细胞活性的报道,大型临床试验中也发现穿心莲内酯对类风湿关节炎病人的症状缓解有一定的作用。但是,其具体的作用机制还不是十分清楚。因此,通过本实验,我们探讨穿心莲内酯对风湿性关节炎骨关节滑膜细胞的作用及其机制,以期为临床用药提供参考。 [目的] 培养纤维细胞样滑膜细胞,研究穿心莲内酯对纤维细胞样滑膜细胞的作用,并对其作用机制进行研究。具体研究内容包括: 1.细胞培养,培养纤维细胞样滑膜细胞; 2.研究穿心莲内酯对滑膜细胞的诱导凋亡作用及其机制; 3.研究穿心莲内酯对滑膜细胞的诱导细胞周期停滞作用及相关机制。 [方法] 1.从15位接受关节置换术的类风湿关节炎病人中的关节滑膜中提取出纤维细胞样滑膜细胞。15位病人随即分为3个亚组,每一亚组中将提取出的滑膜组织混合在一起后再来提取细胞。首先将分离出的滑膜组织粉碎成直径小于1mm的小颗粒,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后,在37度用1mg/mL的胶原酶1进行溶解,震荡2小时。反应后的细胞悬液用孔径70umn的细胞过滤网过滤,然后用细胞培养瓶进行培养,培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM),培养基中有10%的胎牛血清和抗生素(100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素),,条件设置为37摄氏度、二氧化碳浓度为5%。细胞培养基每3天更换一次,细胞铺满后按1:3的比例传代培养。培养后的细胞与纤维细胞样滑膜细胞形态一致,在显微镜下呈现出典型的双极形状。在后续的实验中每个实验均做3次,每个亚组一次。 2.培养后的滑膜细胞在无血清培养基中放置24小时后,用不同浓度的穿心莲内酯进行干预,实验分为四组:(1)空白对照组;(2)低浓度干预组,穿心莲内酯用药浓度为10μM/L;(3)中浓度干预组,穿心莲内酯用药浓度为20μM/L;(4)高浓度干预组,穿心莲内酯用药浓度为30μM/L。在药物干预48小时后,进行各项实验检测。 3.检测内容 (1)MTT法测定细胞生存率。将细胞种植于96孔板中,每个孔中的细胞数大约为10000个,24小时后用上述四组药物进行干预48小时,然后每孔中加入20μL的PBS溶液,其中MTT浓度为5 mg/mL,37摄氏度下培育4小时。用二甲基亚砜充分溶解还原物后用酶联检测仪上测定光密度(OD)值,检测波长540nm,参考波长690nm。 (2)流式细胞术检测细胞周期。将细胞种植于六孔板中,每孔中的细胞数量为2×105,用上述四组药物进行干预,48小时后,收集细胞,碘化丙啶染色,流式细胞仪检测DNA含量。 (3)凋亡检测。参照说明书,用膜连蛋白异氰酸荧光素试剂盒进行凋亡检测。将细胞种植于6孔板中,每孔数量为2×105细胞,孵育24小时后,用上述四组不同浓度药物干预48小时后,在暗房中用5μ1膜连蛋白异氰酸荧光素和10μ1碘化丙啶染色15分钟,染色后马上进行检测。早期的凋亡细胞用膜连蛋白异氰酸荧光素染色为阳性,碘化丙啶染色为阴性。 (4)在提取细胞前,先用1%的十二烷硫酸钠,0.1mM/L苯甲磺酰基氟化物和蛋白酶抑制剂将细胞溶解,裂解物用离心机以13000的转速离心15分钟,取上清以—80℃保存。提取细胞时先加入预冷的抽提试剂,抽提试剂中含有20mM/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸/氢氧化钾(pH 7.5),1.5 mM/L氯化镁,1 mM/L EDTA,1 mM/L二硫苏糖醇,0.1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和蛋白酶抑制剂。然后,将裂解液以每分1000转的转速离心分离细胞核和未破损的细胞。上清液在4℃条件下以每分13000转速离心15分钟。剩余的上清液保存在—80℃以备后续检测。用布拉德福德蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。 (5)蛋白印迹分析。包括制胶、预电泳、加样、电泳分离、转膜、杂交、显色和显影定影等步骤。 (6)细胞凋亡蛋白酶3活性检测。用凋亡蛋白酶3比色测定试剂盒,按照说明书进行检测。将细胞种植于6孔板中,每孔数量为2×105细胞,孵育24小时后,用上述四组不同浓度药物进行干预48小时,加入含有50 mM HEPES. 0.1%CHAPS、1 mM DTT、0.1 mM EDTA和0.1%Triton X-100的溶解剂.细胞裂解液在4℃下以12000转每分转速离心10分钟,将Caspase-3显色底物Ac-DEVD-pNA加入离心后的上清液中,在37摄氏度条件下孵育1小时。阴性对照组未加入显色底物。通过测量吸光度(405nm)来检测凋亡蛋白酶3活性。 [结果] 1.穿心莲内酯可以抑制类风湿关节炎纤维细胞样滑膜细胞的细胞增值并诱导细胞周期停滞。MTT结果说明穿心莲内酯干预显著抑制了滑膜细胞的增生;细胞周期检测显示S期和G2/M期的细胞比例显著下降,而G0/G1期的细胞比例上升。其中,在穿心莲内酯高剂量干预组中,G0/G1期的细胞增多接近30%,S和G2/M期的细胞下降达到50%。在药物干预组中我们还发现,细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21和p27表达水平升高,细胞周期蛋白依赖激酶4水平下降。 2.穿心莲内酯诱导类风湿关节炎纤维细胞样滑膜细胞的细胞凋亡。V/PI染色显示凋亡细胞的数量呈剂量依赖性增多。免疫印迹法显示凋亡相关基因Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平下降。同对照组相比,药物干预组的Bcl-2/Bax的比率显著下降。 3.穿心莲内酯促进细胞色素C的释放和细胞凋亡蛋白酶3的激活。免疫印迹结果显示药物干预组的剪切后细胞凋亡蛋白酶3表达水平升高,且这种表达水平的升高具有浓度依赖性。荧光底物标记的细胞凋亡蛋白酶3的水平也显著升高。Western blot analysis显示细胞色素c的表达水平也呈剂量依赖性的升高。 [结论] 1.穿心莲内酯抑制类风湿关节炎纤维细胞样滑膜细胞的细胞增值。诱导G0/G1期的细胞生长停滞。 2.穿心莲内酯诱导细胞凋亡。穿心莲内酯可以促进细胞色素c从线粒体释放,继而激活凋亡蛋白酶3,引起细胞凋亡。 3.穿心莲内酯有可能为临床上治疗类风湿关节炎的治疗提供参考。


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