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二甲双胍通过抑制IGF-1轴下调良性前列腺上皮细胞生长活性的研究

肖行远  
【摘要】:目的:观察二甲双胍作用后良性前列腺上皮细胞BPH-1和P69的增殖、凋亡和迁移能力改变的情况,并检测二甲双胍对IGF-1促细胞增殖作用的影响。 方法:以不同浓度(0.5、1、5、10mM)二甲双胍处理BPH-1和P69细胞系6h-48h;采用流式细胞计数(FCM)检测药物作用后BPH-1和P69处于凋亡期细胞比例变化;划痕法观察细胞增殖和迁移;MTS比色法和Ki-67荧光染色检测细胞增殖率抑制程度与二甲双胍作用时间和浓度的效应关系;Western-Blot法检测凋亡相关蛋白PARP表达水平变化;单独使用IGF-1(100ng/ml),或与二甲双胍(5mM)联合孵育BPH-1或P69细胞24h,然后用MTS比色法和Ki-67荧光染色检测二甲双胍对IGF-1促前列腺上皮细胞增殖作用的影响。 结果:0.5mM~10mM二甲双胍处理BPH-1和P69细胞6h-48h后,两者的细胞增殖率都显著降低,并且随二甲双胍浓度的增加或作用时间的延长,药物抑制增殖作用逐渐增强。5mM二甲双胍可完全拮抗IGF-1(100ng/ml)诱导的促增殖作用。此外,FCM发现上皮细胞凋亡率在药物处理前后无明显变化,Western-Blot结果进一步发现二甲双胍对凋亡关键蛋白PARP表达水平无影响。 结论:二甲双胍能以时间和剂量依赖的方式抑制良性前列腺上皮细胞BPH-1和P69增殖,但无凋亡诱导作用,同时二甲双胍可拮抗IGF-1的促细胞增殖效果。 目的:IGF-1轴在前列腺上皮生长中发挥重要作用,细胞表面IGF-1受体与配体结合激活下游信号通路,进而刺激上皮细胞生长。本实验检测了二甲双胍对IGF-1受体磷酸化活化抑制作用和对下游信号通路关键调节蛋白表达的影响。 方法:首先用0.5mM-10mM二甲双胍处理BPH-1和P69细胞6h~48h;Western-Blot检测BPH-1细胞受药物作用后IGF-1受体和磷酸化活化IGF-1受体水平,以及IGF-1关键下游生长调节蛋白一胰岛素底物-1(IRS-1),AKT和Erk磷酸活化化水平;并且用免疫荧光染色观察在两个上皮细胞系中单独使用IGF-1(100ng/ml)或联合二甲双胍(5mM)作用48h后,上皮细胞表面磷酸化活化的IGF-1受体表达情况。 结果:Westtern-Blot结果显示,随着二甲双胍的浓度增加和作用时间的延长,IGF-1受体磷酸化水平不断降低;利用图像软件半定量5mM二甲双胍处理BPH-1细胞48h后的结果发现,IGF-1受体磷酸化水平下降约500倍;免疫萤光染色结果显示,IGF-1(100ng/ml)处理48h可以显著提高前列腺上皮细胞表面IGF-1受体活化,但若IGF-1与二甲双胍共同孵育,其促IGF-1受体活化作用消失;Western-Blot结果进一步确认两个上皮细胞系中,二甲双胍可抑制IGF-1在促受体活化作用。 结论:二甲双胍能在抑制前列腺上皮细胞系增殖的同时,以剂量和时间依赖的方式显著下调上皮细胞表面IGF-1受体活化,抑制IGF-1对上皮细胞中IGF-1轴的活化作用。因此,IGF-1信号通路与二甲双胍抑制前列腺上皮细胞增殖的能力有关。 目的:观察二甲双胍对前列腺上皮细胞系BPH-1和P69细胞周期及其周期调节蛋白表达水平的影响,以进一步探讨二甲双胍抑制BPH上皮细胞生长的的分子生物学机制。 方法:Western-Blot检测不同浓度浓度(0.5、1、5、10mM)二甲双胍处理48h后,BPH-1细胞中细胞周期调节蛋白cyclin D家族(cyclin D1、2、3)表达水平变化;使用FCM检测二甲双胍(5mM)和IGF-1(100ng/ml)联合处理和分别单独处理BPH-1,P69细胞后,各个细胞周期细胞比例的变化。 结果:Western-Blot结果显示,BPH-1细胞中cyclin D家族蛋白水平随二甲双胍作用浓度升高而减弱,呈浓度依赖性;FCM结果表明,IGF-1可促进前列腺上皮细胞进入增殖周期(S/G2/M期),而使用二甲双胍干预后S/G2/M期细胞百分比大大降低,联合使用二甲双胍和IGF-1与单独使用IGF-1相比,增殖期细胞分别从41.8%降至26.96%,P0.001(P69细胞)和31.1%将至24.7%,P0.05(BPH-1细胞)。 结论:二甲双胍可将前列腺上皮细胞周期阻滞在Go/G1期,从而抑制细胞增殖。此作用与周期调节蛋白cyclin D表达下调有关。 目的:研究二甲双胍对基质细胞促上皮细胞生长作用的影响以及对基质细胞分泌IGF-1能力的调节,探讨二甲双胍对上皮细胞和基质细胞之间相互作用的效果和机制。方法:首先用基质细胞3T3细胞的条件培养基(3T3-Conditioned Media,3T3-CM)常规培养条件下孵育前列腺上皮细胞BPH-1和P69细胞24h;然后MTS法检测3T3-CM孵育后前列腺上皮细胞系的增殖率,以及二甲双胍(5mM)加入共培养体系后增值率的改变;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测二甲双胍(5mM)处理48h后,基质细胞3T3分泌IGF-1的能力的变化。 结果:与基质细胞条件培养基处理后的上皮细胞增殖率都明显高于对照组(P0.05),而加入二甲双胍(5mM)干预后,BPH-1和P69细胞的增值率降低到对照组水平;ELISA检测发现,二甲双胍可下调基质细胞3T3的IGF-1的分泌能力,培养基中IGF-1含量从574.31pg/ml降至197.61pg/ml, P<0.001。 结论:二甲双胍对上皮细胞和基质细胞间的相互作用有显著的影响,其可抑制基质细胞对上皮细胞生长的促进作用,并且可抑制基质细胞通过旁分泌作用激活上皮细胞的IGF-1轴。但是二甲双胍对基质细胞的影响作用和具体机制还有待于进一步的研究。


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