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功能性自组装多肽纳米纤维凝胶支架联合兔骨髓间充质干细胞治疗兔椎间盘退行性变的实验研究

王佰川  
【摘要】:第一部分功能性多肽的合成及功能性多肽自组装成纳米纤维凝胶 目的:设计合成含有连接蛋白核心序列Link N的功能性多肽两亲性分子RLN,研究其自组装形成凝胶支架的超微结构。 方法:将RADA16和RLN多肽分别溶解于10%无菌蔗糖溶液中,浓度为1%(10mg/ml, m/v),将RADA16与RLN多肽溶液等比例混合(1:1)并用等体积细胞培养基DMEM/F12溶液触发多肽自组装,原子力显微镜检测。 结果:成功合成RADA16和RLN多肽两亲性分子,多肽溶液RLN与RADA16 (1:1)混合自组装形成凝胶。原子力显微镜检测显示:单独RLN多肽不能自组装形成纳米纤维,RADA16和RLN混合多肽(1:1)自组装形成纳米纤维,直径D=31.9±3.8mm,长度可达到几微米。 结论:多肽RADA16和RLN可以自组装形成纳米级凝胶支架(RLN/RADA16, LN-NS),其可以作为髓核组织工程的生物支架材料。 第二部分功能性自组装多肽纳米纤维凝胶支架对髓核细胞生物学行为的影响 目的:研究自行设计的新型、功能性LN-NS凝胶支架对兔髓核细胞生物学行为的影响。 方法:取3周龄普通级日本大耳白兔,无菌条件下取其胸腰段椎间盘髓核组织,Ⅱ型胶原酶消化提取髓核细胞,透射电镜鉴定髓核细胞。在RLN/RADA16多肽混合溶液和RADA16多肽溶液中加入等量细胞培养基DMEM/F12溶液,触发形成LN-NS和RADA16凝胶支架。收集兔髓核细胞,制备单细胞悬液,将细胞接种于多肽凝胶支架材料的内部或表面,钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-am/PI)检测细胞在凝胶内部的存活情况,激光共聚焦显微镜观察细胞三维迁移情况,CCK-8试剂盒检测凝胶支架材料对髓核细胞的黏附情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测髓核细胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,观察功能性功能性LN-NS凝胶支架的细胞学毒性及对髓核细胞黏附、三维迁移及细胞外基质分泌的影响。 结果:髓核细胞贴壁后呈团簇状生长,细胞分为两类:圆形或类圆形的脊索细胞,梭形或多角形的类软骨细胞。透射电镜显示两种细胞内均由大量糖原聚集,其中脊索细胞中含有大小不等的囊泡。Calcein-am/PI检测发现功能性LN-NS凝胶支架无明显的细胞学毒性;激光共聚焦显微镜三维重建图像证实功能性LN-NS凝胶支架明显促进了髓核细胞向凝胶材料内部的迁移;CCK-8试剂盒检测发现功能性LN-NS凝胶支架较RADA16凝胶支架明显促进了细胞的黏附;RT-PCR检测证实功能性LN-NS凝胶支架明显促进了髓核细胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达。 结论:成功分离培养兔椎间盘髓核细胞;功能性自组装多肽纳米纤维凝胶材料LN-NS具有良好的细胞相容性和生物学活性,具有支架和生物活性双重作用,可作为椎间盘组织工程支架材料。 第三部分功能性自组装多肽纳米纤维凝胶支架对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响 目的:研究自行设计的功能性LN-NS凝胶支架对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学行为的影响。 方法:取5周龄普通级日本大耳白兔股骨骨髓,淋巴细胞分离液法分离纯化BMSCs,流式细胞仪检测CD44、D29、D34、D45等表面抗原的表达。收集第三代兔BMSCs,制备单细胞悬液,将BMSCs接种于LN-NS(实验组)和RADA16(对照组)多肽凝胶支架材料的表面,钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-am/PI)检测凝胶材料对BMSCs的毒性情况,CCK-8试剂盒检测凝胶支架材料对髓核细胞的黏附及增殖情况,免疫荧光检测BMSCs细胞外基质(II型胶原)的分泌情况,观察功能性LN-NS凝胶支架对兔BMSCs生物学行为的影响。 结果:纯化细胞贴壁后呈形态均一的长梭形或纺锤形,旋涡状生长,流式细胞仪检测法显示:纯化细胞高表达CD29、CD44,阳性率分别为88.1%和96.2%;低表达CD34、CD45,阳性率分别为3.9%、4.4%。Calcein-am/PI检测发现功能性LN-NS多肽凝胶支架与RADA16凝胶支架具有相似的细胞学毒性;CCK-8试剂盒检测发现功能性LN-NS多肽凝胶支架较RADA16凝胶支架明显促进了细胞的黏附;免疫荧光检测发现培养在功能性LN-NS多肽凝胶支架上的细胞II型胶原分泌高于对照组。 结论:成功分离培养兔BMSCs;功能性LN-NS多肽凝胶材料具有良好的细胞相容性和生物学活性,是一种有前途的髓核组织工程材料。 第四部分功能性自组装多肽纳米纤维支架联合兔骨髓间充质干细胞治疗兔椎间盘退行性变的实验研究 目的:观察功能性LN-NS多肽凝胶材料与兔BMSCs联合移植治疗兔椎间盘退行性变的效果。 方法:采用纤维环穿刺髓核抽吸法制作兔椎间盘退变模型。取2.0-2.5kg日本大耳白兔12只,对兔脊柱L2-3、L3-4、L4-5三个节段椎间盘分别干预如下:L2-3,仅纤维环穿刺抽吸髓核组织;L3-4,抽吸髓核组织后注入包被BMSCs的RADA16凝胶支架;L4-5,抽吸髓核组织后注入包被BMSCs的功能性LN-NS凝胶支架。L1-2节段作为空白对照。术前及术后3周所有实验动物均行脊柱全长核磁共振(MRI)检查,检测椎间盘信号的改变。3周后处死兔,取其干预节段椎间盘,石蜡包埋、切片,HE染色观察髓核组织内细胞情况,免疫组化检测II型胶原的表达情况。 结果:与空白对照组相比,干预节段椎间盘均发生不同程度改变。L2-3节段椎间盘信号%ST2WI值较3周前相比明显下降(p0.05);L3-4节段椎间盘信号%ST2WI值较3周前相比下降;L4-5节段椎间盘信号%ST2WI值较3周前轻度下降。HE染色显示:凝胶支架和BMSCs联合移植后(L3-4,L4-5),髓核组织细胞数量明显增多;免疫组化染色显示:L1-2、L3-4、L4-5髓核组织内均可见大片棕色区域,其间散在棕色颗粒,黄染阳性的类软骨细胞分散于基质中,染色深度以L1-2、L4-5节段髓核组织最为明显,L2-3髓核组织内未见明显棕色颗粒。 结论:纤维环穿刺髓核抽吸法可以成功制作兔椎间盘退变模型,效果可靠。功能性自组装LN-NS多肽凝胶材料与兔BMSCs联合移植可以阻逆椎间盘发生退行性变的进程。


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