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免疫抑制剂处理建立HBV持续复制小鼠模型及其免疫学机制的研究

黄顺梅  
【摘要】:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球重要公共卫生问题之一;而我国亦是HBV感染的高发区。但是,目前用于慢性HBV感染临床治疗的抗病毒药物如干扰素和核苷类似物并不能彻底清除HBV。因此,研发新的药物和探索新的治疗措施是HBV研究领域亟待解决的重要问题。 研发新的抗HBV药物和探索新的治疗措施离不开合适的动物模型。为了探索新的免疫调节治疗策略,我们模拟免疫抑制或免疫功能损伤的HBV感染者,利用高压水注射和免疫抑制剂建立HBV持续复制的BALB/c小鼠模型,并探索了免疫抑制剂影响HBV复制的免疫学机制。 目的 1.分别用不同浓度的地塞米松(Dexamethasome, DEX)、环磷酰胺(Cyclophosphamide,CYP)、雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)、他克莫司(Tacrolimus,FK506)处理HepG2.2.15细胞,寻找安全的药物浓度,并观察安全药物浓度下免疫抑制剂对HBV复制的影响。 2.用免疫抑制剂处理BAL B/c小鼠,6天后给予尾静脉高压水注射质粒pAAV/HBV1.2(A基因型)建立HBV复制小鼠模型。监测不同时间点小鼠的病原血症和抗体反应,分析免疫抑制处理与病毒持续复制时间之间的关系。 3.利用RAPA和生理盐水分别处理BALB/c小鼠,观察对HBV持续复制的影响,同时检测各组小鼠免疫应答,特别是T细胞应答与调节性T细胞应答水平,通过分析病毒复制时间与外周和肝内Treg的频率、T细胞应答的关系,探索Treg的早期活化对病毒复制及T细胞免疫应答的影响,为阐明HBV感染的早期免疫应答及其慢性化机制提供重要的实验和理论依据。 方法 1.分别用不同浓度地塞米松、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司的新鲜培养基处理HepG2.2.15细胞,在第4天培养中止前4小时加入5g/l的MTT20ul,4小时后加入二甲亚砜,酶标仪读取OD570nm值;按细胞存活率大于95%判定此浓度对细胞无毒性,确定药物的安全作用浓度。 2.使用上述免疫抑制剂的安全药物浓度处理HepG2.2.15细胞,72小时后收集细胞培养上清,观察免疫抑制剂对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的影响;提取细胞内DNA,Southern Blot检测免疫抑制剂对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的影响。 3.分别用生理盐水、他克莫司、地塞米松、环磷酰胺和雷帕霉素处理BALB/c小鼠,再将C57BL/6小鼠的皮瓣移植到BALB/c小鼠背部,观测皮瓣的存活时间。从而证实这几种免疫抑制剂治疗能有效抑制机体的免疫系统进而延长移植皮瓣的存活时间。 4.分别用生理盐水、他克莫司、雷帕霉素、地塞米松、环磷酰胺和Anti-asialo GM1抗体处理BALB/c小鼠,并将质粒pAAV/HBV1.2由尾静脉高压水注射小鼠体内,建立HBV复制的小鼠模型。定期采血,ECLIA检测血清内HBsAg、HBsAb、HBcAb的水平,同时抽提血清内的HBV DNA,Real-Time PCR检测血清内的病毒滴度。分析不同的免疫抑制剂及NK抗体阻断对BALB/c小鼠体内HBV复制的影响。 5.分别给BALB/c小鼠生理盐水持续处理、雷帕霉素持续处理,通过ELISA和Real-time PCR检测血清病原学指标动态变化;在不同的时间点处死小鼠,采集血清样本和肝脾并分离肝脏浸润的淋巴细胞和脾细胞,用HBs、HBc多肽刺激脾细胞后,Elispot检测分泌IFN-γ的细胞频率;CD4、CD25和FoxP3染色后流式细胞术检测PBMC、脾细胞及肝脏浸润淋巴细胞(liver infiltrating lymphocytes,LILs)中调节性T细胞(regulatort T cell,Treg)频率及功能的变化。同时抽提肝组织和脾细胞内的RNA,Real-Time PCR检测CD分子和抗病毒相关的细胞因子mRNA的表达水平。分析在尾静脉高压水注射的急性HBV复制小鼠模型中,免疫抑制剂与HBV复制持续时间之间的关系,从而探讨病毒复制与T细胞应答、Treg负性调控之间的关系,为阐明HBV感染早期免疫应答及其慢性化机制提供实验和理论依据。 结果 1. MTT实验表明几种免疫抑制剂的安全作用浓度分别为:环磷酰胺0~1000ug/ml、地塞米松0~500ug/ml、他克莫司0~10ug/ml、雷帕霉素0~0.4ng/ml、阿德福韦0~1ug/ml,在上述范围内的浓度对HepG2.2.15细胞无毒性,且对其HBsAg和HBeAg分泌无影响。 2.将C57BL/6小鼠的皮瓣移植到BALB/c小鼠中,生理盐水处理组的皮瓣存活时间为8.67±1.86天,而他克莫司、地塞米松、雷帕霉素和环磷酰胺处理组的皮瓣存活时间明显延长,分别为21.50±3.09天、21.50±3.09天、20.00±0.71天、21.40±1.52天。 3.通过尾静脉高压水注射将质粒pAAV/HBV1.2导入BALB/c小鼠体内,所有小鼠均能迅速产生较高的抗原血症和病毒血症,小鼠注射后第3天左右抗原血症和病毒血症达到最高峰。生理盐水处理组的病毒血症和抗原血症随后逐渐下降,HBVDNA于4周后完全清除,8周后抗原血症完全消失。而在免疫抑制剂处理期间,RAPA处理组、DEX处理组和CYP处理组的抗原血症和病毒血症均维持在较高的水平。处理停止后,RAPA处理组抗原血症和病毒血症缓慢下降,60%的动物表达HBsAg持续时间超过6个月。DEX处理组停止治疗后,病毒血症快速清除,HBsAg的表达也急剧下降并维持在非常低的水平,60%的动物表达HBsAg持续时间超过6个月。CYP处理组停药后,病毒血症和抗原血症下降缓慢,80%的动物表达HBsAg持续时间超过6个月。Anti-asialo GM1抗体处理组的抗原血症较低,高压水注射后第6周HBsAg完全清除。 4.生理盐水处理组大多数动物能产生HBsAb和HBcAb;雷帕霉素处理组部分动物能产生HBcAb,无HBsAb产生;地塞米松和环磷酰胺处理组均不能产生HBsAb和HBcAb。 5.生理盐水处理组小鼠血清HBsAg在高压水注射后21天清除,HBVDNA在第30天处于检测值下限;雷帕霉素处理组小鼠HBsAg和HBVDNA在第30天仍是阳性。 6.生理盐水处理组小鼠外周血单个核淋巴细胞中Treg的频率从高压水尾静脉注射后第一天开始升高,形成第一峰值,推测可能与高压水尾静脉注射导致的肝损伤所致;尾静脉高压水注射后14天PBMC Treg的频率再次达到峰值;雷帕霉素处理组PBMC Treg频率从高压水注射后第3天开始升高,直到第21天一直保持在相近水平。 7.生理盐水处理组小鼠脾细胞中Treg频率在高压水注射后第10天和20天有升高,第30天恢复到初始水平。雷帕霉素处理组脾细胞Treg频率在上述3各时间点均没有升高。 8.生理盐水处理组小鼠肝脏浸润淋巴细胞中Treg频率在高压水注射后第10天、20天、30天均处于较低水平。雷帕霉素处理组LIL中Treg频率在高压水尾静脉注射后第10天和第30天升高。 9.高压水注射后第30天,雷帕霉素处理组动物的脾细胞分泌IFN-γ的能力较NS治疗组增强。 10.雷帕霉素处理抑制小鼠肝组织CD markers和细胞因子CD3, CD4,CD8, IFN-β,FasL, Perforin, TNFα, IFN-γ的表达,却增强IL10、TGFβ和FoxP3的表达。 11.雷帕霉素处理组病毒持续复制,高压水注射后第30天,所有小鼠肝组织内均能检测到明显的HBV复制。但是在生理盐水处理组,在高压水注射后30天肝内没有HBV复制。 结论 1.地塞米松、环磷酰胺和雷帕霉素在安全浓度范围内对HepG2.2.15细胞无明显细胞毒性;且对HBsAg、HBeAg分泌、HBVDNA复制无影响;提示上述免疫抑制剂并不具有直接的促进或抑制病毒复制的作用。 2.在高压水注射的BALB/c小鼠模型中,用雷帕霉素、地塞米松和环磷酰胺处理能明显延长小鼠移植皮瓣的存活时间;明显延长HBV的复制时间。提示通过上述免疫抑制剂的处理能成功建立免疫抑制剂诱导HBV持续复制模型。 3.雷帕霉素可能通过Treg的活化及增强相关分子的表达从而导致HBV复制的持续。 本研究的创新点 1.以高压水注射的急性HBV复制小鼠模型为背景,利用免疫抑制剂处理,建立免疫抑制剂诱导HBV持续复制小鼠模型,很好的模拟了临床接受免疫抑制剂治疗或机体免疫应答受损的HBV感染者中病毒复制状态,为研究上述患者的发病机制研究及治疗措施评估提供了一个新的可用的动物模型。 2.利用急性和慢性HBV复制小鼠模型,通过检测病毒特异性T细胞、Treg及其相关分子功能在病毒清除或持续过程中的变化,探索了Teg在HBV持续性复制中的作用。 本研究的意义 在急性HBV复制的小鼠模型的基础上,通过免疫抑制剂处理,成功地建立了HBV持续复制小鼠模型,为研究HBV感染的免疫学应答和抗病毒治疗提供了方便实用的小动物模型。另外,我们在此基础上探讨T细胞及Treg功能在急性和慢性HBV复制模型中的区别,为理解HBV感染过程中的免疫学应答提供了新的实验依据。


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