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PYK2与连接蛋白Leupaxin之间的相互关系以及它们对T细胞活化和功能作用的研究

王江玲  
【摘要】:研究目的证明PYK2和连接蛋白Leupaxin(LPXN)之间的相互关系和这一复合体在T细胞活化和功能方面的作用。 研究方法 为了证明PYK2、LPXN之间复合体的存在,我们以急性T细胞淋巴瘤细胞JurkatE6为研究对象,将带有荧光标记的PYK2和LPXN转染入细胞,在fibronectin(FN)刺激下通过蛋白染色技术、荧光显微镜以及激光共聚焦显微镜观察二者在细胞中的定位并利用免疫共沉淀方法证明他们之间的结合。 为了进一步明确PYK2与LPXN之间的作用机制,我们用fibronectin(FN)和Human-SDF-1a(Hu-SDF-1a)刺激JurkatE6细胞并通过免疫共沉淀方法证明PYK2酪氨酸磷酸化与LPXN之间的关系。采用RNA干扰技术和质粒过表达技术,在JurkatE6细胞中将LPXN沉默或者过表达,并将PYK2过表达,观察LPXN蛋白的缺失和过表达以及PYK2的过表达对细胞活化、粘附和运动功能的影响;通过Transwell技术和粘附实验观察不同细胞株(沉默和/或过表达)迁移及粘附能力的变化,并用连续细胞摄影技术(Time lapse cell video)观察不同细胞在接受刺激后的运动和极化能力的变化。最后我们利用质粒过表达技术在外周血淋巴细胞PBL(Peripheral BloodLymphocyto)中亦证实了在LPXN表达缺失的情况下细胞运动能力的改变。 研究结果 复合体的存在和结合可能:(1)通过转染GFP-LPXN和Dsr-PYK2后在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察确定二者的共定位,当受到(FN)刺激以后LPXN从细胞核内移向胞质并和PYK2共同定位在细胞粘附部位;(2)通过免疫共沉淀技术证明了LPXN和PYK2可能结合,进一步证明了复合物的存在的可能性。 复合物间相互作用及其关系:(1)通过免疫共沉淀发现在FN的刺激下LPXN磷酸化增强。在FN和Hu-SDF-1a刺激下,JurkatE6中PYK2的酪氨酸磷酸化呈现出随着时间延长而增强,在刺激2min-5min时达到最大化,以后逐渐减弱的趋势。(2)同时免疫共沉淀显示PYK2除了可以自我磷酸化外,其酪氨酸磷酸化亦能被LPXN所加强,当LPXN过表达时,PYK2的酪氨酸磷酸增多,反之,当LPXN蛋白表达缺失时,则PYK2的酪氨酸磷酸化受限;而在LPXN表达缺失的细胞系中,即使外源性过表达PYK2亦不能观察到其明显的酪氨酸磷酸化,这一现象说明了LPXN对于PYK2酪氨酸磷酸化的加强有着不可或缺的作用。(3)Transwell实验和粘附实验发现,LPXN能增加细胞的粘附能力和减弱细胞的迁移能力,当LPXN表达缺失的细胞,在FN和Hu-SDF-1a的刺激下,粘附细胞明显减少且粘附力减弱,细胞运动能力增强,迁移细胞数较正常对照明显增多,且可以观察到明显的运动轨迹;而在LPXN过表达的细胞中,粘附细胞明显增多且粘附力增强,细胞运动力明显减弱,迁移细胞数则较正常对照减少,没有明显的细胞运动轨迹;(4)连续细胞摄影技术(Time lapse cell video)显示LPXN表达缺失的细胞在受到FN和Hu-SDF-1a的刺激时其去粘附能力明显增强,具体表现为细胞在Hu-SDF-1a趋化下的极化运动能力较正常对照明显增加,而在LPXN过表达的细胞中则粘附增强、运动能力减弱,并且这一结论也在外周血淋巴细胞PBL(Peripheral Blood Lymphocyto)中也得到了证实。 结论 LPXN与PYK2可能形成复合体并相互作用,PYK2除了可以自我磷酸化外,LPXN可以介导并增强其酪氨酸磷酸化从而增强细胞的粘附能力、减弱其运动能力;


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