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脂氧素受体激动剂BML-111对脓毒血症小鼠肺血管内皮通透性的保护作用

唐旻  
【摘要】:第一部分脂氧素受体激动剂BML-111在小鼠脓毒血症所致急性肺损伤中的保护效应 目的建立小鼠脓毒血症模型,探讨脂氧素受体激动剂BML-111对脓毒血症所致急性肺损伤的保护作用。 方法SPF级雄性BALB/c小鼠,6-7周,体重25g左右,随机分成5组:(1)空白组(Control组):小鼠经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重),30mmin后再经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重);(2)对照组(BML-111组):小鼠经腹腔注射BML-111(1mg/kg体重),30mmin后经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重);(3)模型组(LPS组):小鼠经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重),30min后经腹腔注射LPS (10mg/kg体重)建立小鼠脓毒血症;(4)干预组(BML-111+LPS组):小鼠经腹腔注射BML-111(1mg/kg体重),30min后经腹腔注射LPS (10mg/kg体重);(5)拮抗组(Boc-2组):在小鼠给予BML-111和LPS前15min,经腹腔注射Boc-2(50μg/kg体重)。记录5组小鼠的生存情况和体重变化情况。在模型建立24h后,颈动脉放血处死。光学显微镜下观察小鼠肺组织HE染色病理切片并进行肺损伤评分;测定支气管肺泡灌洗(BALF)中性粒细胞数;ELISA法检测肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)的浓度。结果与空白组比较,脓毒血症模型组小鼠死亡率明显上升,建模后24h体重显著下降(p0.01),脓毒血症模型组小鼠肺泡组织结构发生明显改变,肺损伤评分明显升高(p0.01),支气管肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒细胞计数显著提高(P0.01),肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-6浓度显著升高(P0.01)。与脓毒血症模型组小鼠相比,干预组小鼠的存活率明显提高,建模后24h的体重改变程度明显减轻(p0.01);BML-111可以显著减少BALF中中性粒细胞数(P0.01),抑制肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-6的产生(P0.01)。脂氧素受体阻断剂Boo-2可阻断BML-111对炎症反应的抑制作用(P0.01)。 结论BML-111可以改善小鼠脓毒血症的症状,减轻脓毒血症所致急性肺损伤的病变程度,减少中性粒细胞的浸润,减少肺组织炎症介质的产生和渗出,BML-111对脓毒血症所致急性肺损伤具有一定的保护作用。 第二部分脂氧素受体激动剂BML-111对小鼠脓毒血症中肺血管内皮通透性改变的影响 目的探讨脂氧素受体激动剂BML-111对脓毒血症中肺血管内皮通透性改变的影响以及对血管内皮连接蛋白ZO-1和VE-Cadherin表达的影响。 方法SPF级雄性BALB/c小鼠,6-7周,体重25g左右,随机分成5组:(1)空白组(Control组):小鼠经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重),30min后再经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重);(2)对照组(BML-111组):小鼠经腹腔注射BML-111(1mg/kg体重),30min后经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重);(3)模型组(LPS组):小鼠经腹腔注射生理盐水(5ml/kg体重),30min后经腹腔注射LPS (10mg/kg体重)建立小鼠脓毒血症;(4)干预组(BML-111+LPS组):小鼠经腹腔注射BML-111(lmg/kg体重),30min后经腹腔注射LPS (10mg/kg体重);(5)拮抗组(Boc-2组):在小鼠给予BML-111和LPS前15min,经腹腔注射Boc-2(5Oμg/kg体重)。5组小鼠在模型建立后24h,颈动脉放血处死。测定小鼠肺组织湿/干重比(wet/dry weight ratio, W/D);检测支气管肺泡灌洗液中(BALF)的总蛋白浓度;Evans Blue法检测肺血管渗透性改变;Western Blot法检测肺组织血管内皮连接蛋白ZO-1及VE-Cadherin的蛋白表达水平。 结果与空白组相比,脓毒血症模型组小鼠肺组织渗出增加(W/D比)p0.01),血管内皮通透性增高(Evans Blue吸光度)p0.01),支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度显著提高(P0.01),肺组织血管内皮连接蛋白ZO-1及VE-Cadherin的蛋白表达水平降低(P0.05)。与脓毒血症模型相比,脂氧素受体激动剂BML-111可显著减少肺组织的渗出(W/D比)(P0.01),减轻肺组织微血管Evans Blue的渗透(P0.01),显著降低支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白浓度(P0.01),上调肺组织中ZO-1及VE-Cadherin的蛋白表达水平(P0.05)。脂氧素受体阻断剂Boc-2能显著阻断脂氧素受体激动剂BML-111对肺血管内皮通透性改变的保护作用。 结论BML-111可明显降低肺血管内皮通透性增加所引起的肺水肿和大分子物质渗出。BML-111可能是通过上调血管内皮黏附连接蛋白VE-Cadherin和紧密连接蛋白ZO-1的表达这一分子机制来实现其对维持肺血管内皮结构完整和肺泡-毛细胞血管屏障功能的保护作用。 第三部分脂氧素受体激动剂BML-111对脂多糖诱导的内皮细胞连接蛋白表达的影响 目的研究脂氧素受体激动剂BML-111对脂多糖诱导人内皮细胞(EA.hy926)血管内皮连接蛋白ZO-1和VE-Cadherin表达的影响。 方法以1μg/ml浓度的LPS刺激体外培养人内皮细胞株EA.hy926,根据药物不同将细胞分成5组(1)空白组(Control组):用无血清DMEM高糖培养基处理;(2)对照组(BML-111组):用含200nM BML-111的无血清DMEM高糖培养基处理;(3)模型组(LPS组):用含1μg/ml LPS的无血清DMEM高糖培养基处理;(4)干预组(BML-111+LPS组):用含不同浓度BML-111(50nM、200nM)的无血清培养基处理30min后加终浓度为1μ/gml的LPS处理;(5)拮抗组(Boc-2组):在给予200nMBML-111和LPS处理前,加入100μMBoc-2处理15min。采用Western blot法检测内皮细胞连接蛋白ZO-1和VE-Cadherin表达以及内皮细胞MAPKs蛋白和Akt蛋白磷酸化作用。采用免疫荧光法检测内皮细胞上连接蛋白ZO-1和VE-Cadherin的分布表达。 结果Western blot和免疫荧光结果均表示,1μg/m;LPS刺激内皮细胞可抑制ZO-1和VE-Cadherin的表达(P0.05)。200nM BML-111预处理可上调ZO-1和VE-Cadherin的表达(P0.05),使内皮细胞恢复正常排列。200nMBML-111可抑制LPS诱导的内皮细胞Akt、ERK1/2、p38-MAPK的磷酸化。 结论BML-111通过上调内皮细胞连接蛋白ZO-1和VE-Cadherin的表达和抑制LPS诱导的内皮细胞Akt、ERK1/2、p38-MAPK的磷酸化,发挥其稳定内皮细胞结构、维持其正常功能的抗炎和促炎症消退作用。


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