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洋葱假单胞菌脂肪酶在非水相介质中构效关系的研究

陈大伟  
【摘要】:与化学催化剂相比,脂肪酶催化剂具有反应条件温和、催化效率高、过程能耗低和环境友好等优点,但制备成本相对较高,且易失活和稳定性差,上述不足严重制约了脂肪酶的工业化应用。为解决这些问题,国内外学者尝试通过溶剂工程和蛋白质工程等方法提高脂肪酶的活性和稳定性,从而降低催化反应的生产成本。洋葱假单胞菌脂肪酶(PCL)被广泛应用于有机相催化反应,但其在非水相介质中的活力变化机制尚未完全清楚。本文以脂肪酶PCL为对象,通过溶剂工程的手段,详细研究了5种有机溶剂、19种离子液体和高压CO_2对脂肪酶活力和结构的影响,筛选出了适合脂肪酶PCL催化的最适反应介质,并初步阐释了脂肪酶PCL在非水相介质中活力变化的内在机制;为脂肪酶PCL的生产应用提供了理论基础和技术支撑。主要研究内容和结果摘要如下: 1.有机溶剂对脂肪酶PCL活力和结构的影响。研究了脂肪酶PCL在有机溶剂体系中的催化反应,40°C摇床反应12h后气相色谱分析生物柴油得率。结果表明,生物柴油得率随有机溶剂logP的增加而降低,即脂肪酶PCL在亲水性有机溶剂(叔戊醇和叔丁醇)中有较高生物柴油得率,而在疏水性有机溶剂(石油醚、正己烷和异辛烷)中则表现出较低活力,可能是由于反应底物与产物在亲水性有机溶剂中能够形成均一反应体系,增加了底物与酶的接触机率,并降低了反应底物甲醇和反应产物甘油对脂肪酶的毒害作用。红外光谱分析表明,有机溶剂对脂肪酶PCL的二级结构产生了不同程度的影响,且脂肪酶PCL活力的增加可能是由于α-螺旋含量的降低导致酶的活性中心暴露、从而使酶更容易与底物接触的缘故。荧光光谱分析表明,有机溶剂使脂肪酶PCL的三级结构也发生了变化,且蛋白质荧光强度的增加与其活力的提高成正比关系。 2.离子液体对脂肪酶PCL活力和结构的影响。研究了脂肪酶PCL在离子液体中的活力变化,反应底物大豆油和甲醇在40°C反应12h后,GC分析生物柴油得率。结果表明,阴离子对脂肪酶活力影响的差异性远大于阳离子,含有疏水性阴离子[PF_6]~–和[Tf_2N]~–的离子液体适合作为反应溶剂,脂肪酶PCL在两性离子液体[Ompy][BF4]中得到最高生物柴油得率为82.3%;而脂肪酶在亲水性和亲核性离子液体中则表现出较低的催化活力,可能是由于亲水性离子液体影响了脂肪酶微环境中必需水的含量,导致脂肪酶的空间构象发生了变化,而亲核性离子液体则易吸附在脂肪酶活性中心附近,从而阻碍了催化中心与底物的结合。红外光谱分析表明,脂肪酶PCL的二级结构在离子液体中发生了不同程度的变化,而脂肪酶PCL活力的增加可能是α-螺旋含量的降低使蛋白质的活性中心暴露,从而使底物更容易进入。 3.高压CO_2对液体脂肪酶PCL催化特性的影响。研究了液体脂肪酶PCL在高压CO_2中活力、结构和稳定性的变化,以橄榄油为反应底物,测定了高压处理脂肪酶PCL的水解活力。实验结果表明,压力和温度的增加显著提高了液体脂肪酶的水解活力,可能是由于高压CO_2与脂肪酶的相互作用使蛋白质的结构发生变化所致。反应动力学表明,高压处理提高了液体脂肪酶PCL的最大反应速度Vmax,降低反应的活化能Ea,但显著降低了对底物的亲和力和催化效率,蛋白质的热稳定性和对亲水性有机溶剂的耐受性也显著性降低。SDS-PAGE表明,高压处理没有使蛋白质发生聚集或断裂,说明高压CO_2对液体脂肪酶的一级结构未产生影响。圆二色和荧光光谱分析表明,6MPa/35°C处理液体脂肪酶PCL的活力变化主要是由于高压导致蛋白质二级结构发生变化所致;而10MPa/40°C处理脂肪酶PCL的活力变化则与蛋白质二级和三级结构发生变化有关。在亚临界和超临界条件下,处理时间对液体脂肪酶PCL的三级结构几乎无影响。 4.高压CO_2对固体脂肪酶PCL催化特性的影响。采用中心实验设计研究了压力、温度和处理时间对固体脂肪酶活力、结构和稳定性的影响。实验结果表明,亚超临界CO_2处理对固体脂肪酶PCL的活力都有不同程度的提高,最高活力分别为125.9%和130.4%,且超临界CO_2处理要明显好于亚临界处理,但压力、温度和处理时间对脂肪酶PCL的活力均没有显著性影响。红外和荧光图谱分析表明,亚临界处理脂肪酶PCL的活力随蛋白质α-螺旋含量的增加而降低;而超临界处理固体脂肪酶PCL的活力变化主要是由于蛋白质的二级和三级结构发生变化所致,荧光强度随着压力的增加而逐渐降低。脂肪酶PCL的稳定性分析表明,高压处理固体脂肪酶PCL对亲水性有机溶剂的耐受性显著性降低,超临界处理使固体脂肪酶的热稳定性也有显著性降低,DSC结果也验证了这一点。


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