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当归多糖抑制正常大鼠及慢性炎症贫血(ACD)大鼠hepcidin表达的研究

李明明  
【摘要】:铁调素(hepcidin)由肝细胞分泌的25个氨基酸抗菌肽组成,是维持机体铁稳态的一种关键性―核心负性调节因子‖,在铁转移通路中发挥着主要作用。当机体hepcidin受抑制时,肠道铁吸收及巨噬细胞铁释放增加,使更多的铁离子可被吸收并利用来造血。本课题组已通过实验证明,给药当归多糖(ASP)两周以后,正常大鼠肝脏中hepcidin的表达水平明显下降。本次实验主要目的是研究当归多糖抑制正常大鼠hepcidin的表达是否具有量效依赖关系,以及当归多糖抑制正常大鼠hepcidin表达的分子机制。 临床检测发现慢性炎症贫血患者体内hepcidin含量显著升高,为进一步研究当归多糖能否通过下调hepcidin的含量对慢性炎症贫血发挥治疗作用,我们采用足跖注射弗氏完全佐剂建立慢性炎症贫血(ACD)大鼠模型。检测灌胃不同浓度当归多糖后ACD大鼠体内hepcidin、血常规、血清铁及炎性因子等指标的变化,研究当归多糖调节ACD大鼠hepcidin表达的分子机制。 第一部分不同浓度当归多糖对正常大鼠体内hepcidin表达的抑制作用及分子机制研究 采用传统的水煮法从当归饮片中提取当归多糖,合并得到的两次水提液。水提液中加入一定量的Ca(OH)2生成絮状沉淀,除去蛋白质、鞣酸等杂质。滤液加浓硫酸调节PH至5—6,既能除杂又调整了溶液PH,在60℃烘箱中烘干成浸膏状。采用5%苯酚—硫酸法测定当归浸膏的糖含量,用无水葡萄糖配制对照品溶液,绘制标准曲线计算得浸膏糖含量均在70%以上,满足灌胃给药的要求。 将48只健康SD雄性大鼠,随机分成6组,每组8只。阴性对照组每天灌胃生理盐水1mL,连续给药20天;阳性对照组分为低剂量组(腹腔注射rhEPO800U/kg)和高剂量组(腹腔注射rhEPO2000U/kg),每日注射一次连续给药3天。实验组大鼠分低、中、高三个剂量,分别灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg当归多糖20天。给药前及给药完成后分别对各大鼠进行一次眼眶取血,用于测定血液相关指标的含量变化。将大鼠处死后取肝脏,烘干至恒重测定肝脏铁含量。结果发现灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg当归多糖组大鼠与给药前相比,血清hepcidin含量分别下降了19.4%,27.1%和31.2%。随着当归多糖给药剂量的增加,对hepcidin的抑制作用增强。腹腔注射rhEPO800U/kg和rhEPO2000U/kg的正常大鼠,血清hepcidin分别下降了24.3%和29.5%。与阴性对照组相比,rhEPO两个剂量组的红细胞、血红蛋白含量均显著升高,而低、中、高三个当归多糖剂量组的红细胞、血红蛋白含量无明显变化。阴性对照组血清铁含量为2.71±0.53mg/L,800U/kg rhEPO和2000U/kg rhEPO组大鼠血清铁含量分别为2.08±0.39mg/L、1.70±0.18mg/L,与阴性对照组比较,EPO显著降低血清铁含量。实验组中只有高剂量(1.2g/kg)当归多糖组血清铁含量显著降低,为1.68±0.27mg/L。阳性对照组的肝脏铁含量也显著降低,同时1.2g/kg当归多糖大鼠肝脏铁含量出现明显的下降,这是因为铁在机体中重新分配以满足红细胞生成的需要。 从正常大鼠肝脏提取组织蛋白液,蛋白免疫印迹法(western blot)检测信号因子含量。结果显示,ASP通过下调肝细胞JAK2总蛋白含量,使得p-JAK2相应减少。与JAK2总蛋白含量相比,2000U/kg rhEPO给药组大鼠的p-JAK2含量显著降低,说明EPO主要抑制JAK2蛋白磷酸化过程而不是抑制总蛋白JAK2的表达。ASP和rhEPO均能显著下调p-SMAD1/5/8含量,使得进入细胞核内与hepcidin基因启动子相结合的磷酸化二聚物合成受阻,抑制hepcidin的表达。与阴性对照组相比,ASP和rhEPO给药组的信号蛋白Erk1/2和TMPRSS6含量无明显变化,说明ASP和rhEPO不能通过Erk1/2和TMPRSS6途径抑制hepcidin表达。 第二部分不同浓度当归多糖对ACD大鼠体内hepcidin表达的抑制作用及分子机制研究 SD雄性大鼠足跖注射100ul含10mg/ml结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂(CFA),建立慢性炎症贫血(ACD)模型。注射侧后足在给药后出现原发性肿胀,非注射对侧足和前足在注射后第十天继发肿胀发生明显,耳朵、尾巴红肿甚至出现关节炎“结节”等继发病变。与对照组相比,模型组大鼠红细胞、血红蛋白和血清铁含量降低,分别为6.06×10~(12)/L,92.4g/L和1.78mg/L,而炎症相关指标如白细胞计数、IL-6和TNF-α含量显著升高,分别为2.58×10~(10)/L,84.10pg/ml和68.34pg/ml,弗氏完全佐剂建立的模型符合ACD的发病特征。 治疗ACD的关键是抗炎以及改善贫血,实验组的ACD大鼠每天分别灌胃0.5g/kg和1.0g/kg的当归多糖,连续给药4周。阳性对照组是每天给ACD大鼠灌胃10mg/kg双氯芬酸钠,连续给药4周。测量足肿胀,以及检测血常规、hepcidin、血清铁和炎性因子等指标。高剂量当归多糖组(1.0g/kg)比低剂量当归多糖组(0.5g/kg)抑制ACD大鼠hepcidin表达的作用强,抑制率分别为43.1%和28.7%。与模型组大鼠相比,双氯芬酸钠组的血清hepcidin含量也显著降低了38.0%。双氯芬酸钠抑制ACD大鼠原发性足肿胀和继发性足肿胀的作用均强于1.0g/kg当归多糖高剂量组。模型组大鼠白细胞计数2.58×10~(10)/L,给药双氯芬酸钠和1.0g/kg当归多糖治疗后白细胞含量显著下降,分别为1.59×10~(10)/L和1.77×10~(10)/L。双氯芬酸钠和当归多糖均能显著下调ACD大鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α的含量,并且双氯芬酸钠的抑制作用更显著。观察足部X光和滑膜苏木素-伊红(H-E)染色切片发现双氯芬酸钠对大鼠关节保护、下调炎症细胞含量的作用最显著。这说明双氯芬酸钠对ACD大鼠的抗炎作用强于1.0g/kg当归多糖。模型组大鼠红细胞计数6.06×10~(12)/L,给药双氯芬酸钠和1.0g/kg当归多糖治疗后红细胞含量显著升高,分别为7.68×10~(12)/L和8.16×10~(12)/L。1.0g/kg当归多糖治疗的ACD大鼠不仅红细胞含量明显增加,与模型组比较,其血红蛋白和血清铁等铁代谢相关指标含量也显著升高,这表明当归多糖(1.0g/kg)对ACD大鼠的―补血补铁‖效果十分显著。高剂量当归多糖对ACD大鼠的治疗作用强于当归多糖低剂量组。 Western blot结果显示,当归多糖和双氯芬酸钠均能通过下调ACD大鼠肝脏信号蛋白JAK2、STAT3和p-SMAD1/5/8含量抑制hepcidin的表达。高剂量(1.0g/kg)当归多糖比低剂量当归多糖(0.5g/kg)更显著降低信号蛋白含量。在分别给药当归多糖和双氯芬酸钠的ACD大鼠中,1.0g/kg当归多糖组大鼠的三种信号蛋白含量最低,分别为JAK2含量39.5%、STAT3含量8.1%以及p-SMAD1/5/8含量42.0%。这可能是与双氯芬酸钠相比,1.0g/kg当归多糖能够更显著抑制hepcidin表达的原因之一。


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