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HSP47-shRNA干预日本血吸虫鼠肝纤维化对活化的HSC受体表达的影响

陶然  
【摘要】:【背景及目的】 全球约有2亿人感染血吸虫,流行于亚、非、拉,中国属重感染区之一,其中1亿2千万人有临床症状,2千万人发病[1,2]。目前在中国仍有多达5千万人面临日本血吸虫感染的危险[3]。作为危害人类健康的常见寄生虫疾病,血吸虫肝纤维化的发病机制和治疗方面的研究仍是临床基础研究的重点之一。 血吸虫病肝纤维化在引起机体致病的同时,机体也会对血吸虫形成耐受机制,也因虫体抗原伪装逃避机体攻击而得以长期寄生。虫卵沉积和肉芽肿反应导致纤维组织在肝脏中的积累,尤其门脉周围纤维化阻塞通往肝脏的血流,最终形成门静脉高压。门静脉高压症(portal hypertension,PHT)是一种常见的临床综合征,可引起严重并发症危及生命。内皮素(endothelin, ET),作为迄今发现的最强的缩血管肽类物质,它于1988由日本学者Yanagisawa等[4]从猪主动脉内皮细胞培养液中分离出来,分别有三种异构肽:ET-1、ET-2、ET-3;其中,ET-1对血管平滑肌的作用最强。内皮素受体(endothelin receptor,ETR)则分为ETAR和ETBR, ETAR与ET的亲和力表现为:ET-1 ET-2ET-3, ETBR则与三种异构肽亲和力相同。众所周知,ETR的表达数量及功能决定了ET的生物学效应。动物体内许多组织都能同时表达ETAR和ETBR,但各组织的ETR比例却各有不同;组织ETR的分布情况决定了ET在该组织的作用,ET与其受体之间也可能存在负反馈调节机制;在PHT的不同阶段,同一组织内皮素受体的表达分布也不相同;有关ETR受体拮抗剂已经为药物治疗提供了新的研究领域。 肝纤维化发生发展离不开肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)持续激活。HSCs在激活的过程中会表达细胞因子及其受体,如ET-1和ET-1A、B型受体、转化生长因子(transforming growthfactor-β,TGF-β)和TGF-β I、II、III型受体、血小板衍生的生长因子Plateletderived growth-factor,PDGF)和PDGF受体的α、β亚单位等等。低氧、年龄、活化状态、分布密度等均可影响HSCs表面受体的表达。HSCs与内皮素系统(Endothelin system,ETS)相互作用,其效应在肝内外血管阻力形成、门静脉血流量变化及肝纤维化进展中都起到关键作用[5,6]。 HSP47(heat shock protein47,HSP47)是机体受到应激后合成增加的应激蛋白,主要存在于肝星状细胞的内质网中,参与胶原的折叠与分泌,影响肝纤维化的进展[7]。HSP47在多种疾病纤维化病理过程中显著上调,其参与胶原合成,其表达量影响纤维化进展;抑制HSP47表达可抑制胶原合成及组织纤维化[8,9]。血吸虫感染所引起的肝纤维化与ETR表达的关系,国内外报道甚少;HSP47在肝纤维化病理过程中究竟如何调控,目前也有待进一步深入研究;本研究旨在应用HSP47-shRNA干预鼠血吸虫肝纤维化,探索其对HSCs受体表达的影响,寻找新的诊断指标及治疗靶点。 【方法】 利用脂质体转染技术,将本实验构建的HSP47-shRNA干扰质粒转染入小鼠成纤维细胞(NIH/3T3细胞),同时设立非相关对照组(Negative control-shRNA)。分别利用实时定量PCR和western-blot方法检测NIH/3T3细胞HSP47mRNA及蛋白水平的表达;流式检测转染后NIH/3T3膜受体表达。上述同样分组,将shRNA干扰质粒经尾静脉高压注射,自日本血吸虫小鼠感染第9W开始干预至感染第14W,动态检测模型门静脉压力改变;实时定量PCR和western-blot检测体内干预HSP47效应;流式检测HSCs膜受体表达变化。 【结果】 Real-time PCR检测转染后NIH/3T3细胞HSP47-mRNA表达,结果显示转染24h(图2,A)干扰质粒对HSP47-mRNA抑制相对表达量为(25.39±2.358)%、转染48h(图2,B)为(48.71±1.391)%,分别于同转染时间非相关对照组比较,差异具有统计学意义(p0.01)。同时检测转染48h HSP47蛋白表达,结果与HSP47-mRNA一致。同时利用流式细胞术检测转染后ET-B受体表达,转染48h为(30.825±5.460)%,与转染前(53.433±5.243)%有显著差异(p0.05)。TGF-β受体、PDGF受体分别检测,转染前后均无显著变化。 感染第9周,尾静脉注射HSP47-shRNA至感染第14W, HSP47-mRNA相对表达量下调至(2.686±0.7114),与对照组(6.001±0.4583)比较,具有统计学意义(p0.01)。HSP47蛋白表达经Western-blot检测,与mRNA变化一致。ShRNA干预组HSCs ETAR与ETBR平均荧光强度(MFI)与感染组相比,均显著变化(p0.05)。ETAR由感染组(8538±493.71)降至(4249±344.42),ETBR则由感染组(5052±212.93)降至干预组(3706±193.76)。 【结论】 本研究将针对小鼠HSP47的shRNA干扰质粒,经体内外实验均证明其在基因及蛋白质水平能有效干扰HSP47的表达。体外实验沉默HSP47后,NIH/3T3表达ETBR升高;应用干扰质粒体内干预血吸虫肝纤维化小鼠,干预组门静脉压力及ETR显著降低;同时分析HSP47-mRNA与血吸虫肝纤维化进展ETR呈正相关。故由此推测HSP47与HSCs及ETS之间可能存在反馈调节机制,使之对肝纤维化调节具有维稳性。


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