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基于人工抗体的内毒素快速检测方法研究

张梦  
【摘要】:内毒素广泛存在空气、土壤和水等环境介质中。被内毒素污染的水进入人体后,小剂量的内毒素(1-5ng/kg体重)即可引起体温上升,产生内毒素休克,播散性血管内凝血等症状,严重威胁人群健康。内毒素不易被加热、氯化消毒破坏,因此,实时监测水环境中的痕量内毒素十分重要。人工抗体(又称分子印迹聚合物,MIP)可特异性识别和结合靶分子,能够代替天然抗体,与酶联免疫(ELISA)和表面等离子共振(SPR)技术联用,建立快速测定内毒素的新方法,用于实时监测水环境中的内毒素。 本研究主要包括下述两个部分: 第一部分人工抗体-酶联免疫法检测痕量内毒素 目的:将MIP与ELISA联用,建立集特异性样品预处理和ELISA检测于一体的人工抗体-酶联免疫法(MIP-ELISA),检测环境水样品中痕量内毒素。 方法:以多巴胺为功能单体,内毒素为模板分子,在酶标板上合成MIP。将该MIP作为包被抗体,特异性分离富集样品中的痕量内毒素,然后加入兔抗内毒素多克隆抗体,与MIP结合的内毒素形成抗原-抗体结合物,再加入酶标二抗,最后加入发光底物,利用增强化学发光法(ECL)测定内毒素含量。对MIP-ELISA检测内毒素的灵敏度,线性范围,稳定性及特异性进行评价,并利用MIP-ELISA检测自来水、江水和医院污水中痕量的内毒素。 结果:在直接上样100μL时,MP-ELISA检测内毒素的灵敏度为10ng/mL,线性范围为10ng/mL~100ng/mL,对内毒素加标(10-100ng/mL)的江水样品回收率在83.6%~101.7%,日内和日间偏差均小于5%(n=6)。MIP-ELISA测定革兰氏阴性菌——大肠杆菌、明亮发光杆菌和绿脓杆菌(菌液浓度为105cfu/mL)中的内毒素浓度分别为99.15±2.79ng/mL,112.63±3.68ng/mL,113.74±3.58ng/mL,革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌(菌液浓度为105cfu/mL)的检测结果为阴性,测定自来水,江水,医院污水中的内毒素浓度分别为18.2±2.6ng/mL,52.6±2.9ng/mL,99.3±1.8ng/mL。MIP-ELISA与标准方法(鲎试剂法)的检测结果相当(p0.05)。 结论:MIP-ELISA对内毒素的定量准确,可靠,能够用于环境水样品中痕量内毒素的检测。 第二部分人工抗体-SPR法快速检测内毒素 目的:将MIP与SPR联用,建立可快速检测内毒素的人工抗体-SPR法(MIP-SPR)。 方法:以多巴胺为功能单体,内毒素为模板分子,在SPR芯片金膜表面合成MIP。将MIP-SPR芯片用于SPR仪,快速检测内毒素。对MIP-SPR检测内毒素的灵敏度,线性范围,稳定性及特异性进行评价,检测自来水、江水和医院污水中的内毒素含量。 结果:MIP-SPR检测内毒素的线性范围为0.01~100ng/mL,灵敏度为0.01ng/mL,对内毒素加标(10~40ng/mL)的自来水样品回收率在86.9%~91.6%,日内和日间偏差均小于5%(n=6)。MIP-SPR测定革兰氏阴性菌——大肠杆菌、明亮发光杆菌和绿脓杆菌(菌液浓度为103cfu/mL)中的内毒素浓度分别为0.86±0.18ng/mL,0.73+0.13ng/mL,1.22±0.08ng/mL,革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌(菌液浓度为103cfu/mL)的检测结果为阴性,测定自来水,江水,医院污水中的内毒素浓度分别为14.8±1.9ng/mL,50.1±2.2ng/mL,96.6±2.8ng/mL。MIP-SPR与标准方法(鲎试剂法)的测定结果相当(p0.05)。 结论:MIP-SPR对内毒素的定量准确,可靠,可直接用于环境水样品中内毒素的快速检测。


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