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铁皮石斛多糖的分离纯化及调节糖代谢紊乱的机制研究

税维智  
【摘要】:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以机体糖代谢紊乱为特点的疾病,对人们的健康具有严重不良影响。据世界卫生组织统计,在糖尿病患者人群中,Ⅱ型糖尿病是糖尿病的主要组成部分,占90%以上且具明显上升趋势,严重威胁着人们的健康。由于传统的治疗糖尿病的药物具有严重肝肾毒性、低血糖、胃肠道等副作用,因此研究开发新的预防和治疗糖尿病的天然药品和保健食品具有重要意义。在寻找与开发新药过程中发现,许多中药多糖具有安全、无毒副作用的优势,这使中药多糖的研究越来越受到重视。近年来的研究表明,铁皮石斛富含石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物等活性成分,具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、增强机体免疫力等功效,而DOP是其发挥降低机体血糖的重要成分。目前已有DOP及其方剂用于预防、治疗糖尿病的报道,但从分子水平探讨DOP降糖作用机制的甚少。因此,深入研究DOP降糖活性,阐明其降糖作用机制变得十分重要。本文以铁皮石斛为原料,提取纯化后得到性状稳定的DOP,在此基础上研究DOP对Ⅱ型糖尿病的治疗及其作用机制,为DOP的临床应用和保健品的开发提供新的理论和实验基础。第一部分铁皮石斛多糖的分离及纯化采用宜昌铁皮石斛为原料,经水提醇沉法得到铁皮石斛粗多糖。粗多糖溶液经低浓度H2O2脱色、反复冻融去除溶液中鞣酸及蛋白,所得多糖溶液经透析袋透析除去蛋白质及杂质,最后通过G50凝胶色谱柱进行层析分离,冷冻干燥得到精制DOP(DOP),苯酚-硫酸法检测其糖含量为105%;高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定其重均分子质量为1.264×105Da,且分子量均一;紫外扫描显示DOP几乎不含核酸和蛋白质;PMP柱前衍生高效液相色谱法检测其由葡甘露聚糖组成。以上结果显示,本方法制备的DOP性状良好,纯度满足后续实验要求。第二部分铁皮石斛多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠的治疗作用研究采用HFD喂养联合多次腹腔注射小剂量(STZ)的方法,诱导建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型。随机选取50只小鼠,给予高脂高糖饲料喂养;另随机选取10只作为NC组,全程给予普通饲料喂养。高脂高糖饲料喂养4周后注射STZ(i.p.,q.w.d.,66mg/kg)。再4周后测定血糖,以空腹血糖FBG11.1mmol/L为成功建立Ⅱ型糖尿病模型标准,造模成功率达90%。取造模成功的小鼠,随机分为4组,每组10只。分别设为模型组(灌胃给予等体积的生理盐水,b.l.d.×28),DOP低、中、高剂量组(分别灌胃给予DOP100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg,b.l.d.×28)。实验过程中定期观察小鼠活动状态,记录体重及血糖。灌胃第25天进行口服葡萄糖耐量(OGTT)试验,灌胃第28天测定糖尿病小鼠血清胰岛素(FINS),血脂,肌肝糖原相关指标及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等相关抗氧化酶活性。实验结果表明,给予DOP后,给药组小鼠精神状态明显好转,体重下降趋势明显减弱,血糖水平也较模型组明显降低。同时,通过口服葡萄糖耐量(OGTT)试验和胰岛素抵抗评价指数(HOMA-IR)证实,DOP能够显著提高糖尿病小鼠对葡萄糖的耐受力,增加糖尿病小鼠血清胰岛素水平和降低胰岛素抵抗指数。此外,DOP能够显著降低糖尿病小鼠总胆固醇与甘油三酯水平,并低(100mg/kg)、中(200mg/kg)、高(400mg/kg)剂量组呈明显的剂量依赖性,表明DOP具有调节糖尿病小鼠血脂代谢紊乱的作用。给予DOP4周后,给药铁皮石斛干预治疗组小鼠血清中GSH含量增加,GSH-PX活力增强,SOD含量显著增加,均表现为低(100mg/kg)、中(200mg/kg)、高(400mg/kg)剂量组显著剂量依赖性;同时,DOP可显著降低糖尿病小鼠MDA含量,低(100mg/kg)、中(200mg/kg)、高(400mg/kg)剂量组血脂降低水平呈明显的剂量依赖性。以上结果证实,DOP能够提高糖尿病小鼠体内抗氧化物酶的活性和降低脂质过氧化物的含量,从而增强清除自由基的能力和降低活性氧的产生,发挥抗氧化应激,防止氧化损伤的作用。推测抗氧化应激可能是DOP抗糖尿病和缓解胰岛素抵抗的途径之一。第三部分铁皮石斛多糖调节糖代谢紊乱的机制研究从组织形态学探讨DOP调节糖代谢紊乱的作用机制。对糖尿病小鼠肝组织进行HE染色、PAS染色,观察糖尿病小鼠肝组织形态变化及定性检测肝糖原含量。通过HE组织切片,空白对照组小鼠肝脏结构完整,清晰。肝细胞排列规则,胞浆均匀,形态正常。模型组对照组小鼠肝细胞排列紊乱,有明显的脂肪变性,出现明显胞核和胞浆分离的现象。给药组小鼠肝细胞与模型组相比,结构清晰,细胞排列规则,肝细胞脂肪变性显著减少且具有剂量依赖性;通过PAS组织切片,模型组小鼠肝细胞胞浆内紫红色颗粒较少,细胞排列松散。较模型组,给药组肝细胞胞浆内紫红色颗粒明显增多致密且具有剂量依赖性。实验结果表明,经过DOP的治疗,Ⅱ型糖尿病小鼠肝组织损伤在一定程度上得以修复且肝组织内糖原含量明显升高。从而揭示DOP能够通过对糖尿病肝组织的保护作用及增加肝组织肝糖原的合成来调节糖代谢。此外,从分子水平探讨DOP调节糖代谢紊乱机制。采用Western blot法测定糖尿病小鼠肝组织中胰岛素信号转导通路关键蛋白IRS-β、IRS1,JNK、PI3K和Glut2的表达。结果显示,DOP可以显著抑制糖尿病小鼠肝组织内JNK蛋白的表达,低(100mg/kg)、中(200mg/kg)、高(400mg/kg)剂量组JNK蛋白表达抑制率分别为35.31%、68.77%、84.88%,呈显著的剂量依赖关系。同时,DOP能够显著提高糖尿病小鼠肝组织内IRS-β、PI3K、AKT和Glut2蛋白的表达水平。本部分实验进一步证实了DOP可以通过抗氧化应激作用,抑制糖尿病小鼠肝组织中JNK蛋白的表达,从而促进IRS1与IRS-β结合,从而促进PI3K蛋白表达,进而影响胰岛素信号通路,促使Glut2蛋白表达,最终发挥调节糖代谢紊乱的作用。


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