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MAP3K3介导NF-κB信号通路对卵巢癌生物学行为影响的初步研究

贾薇  
【摘要】:第一部分MAP3K3在卵巢癌组织中的表达及临床意义研究目的:探讨MAP3K3在卵巢癌组织中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化染色和荧光实时定量PCR的方法检测93例卵巢癌和33例输卵管组织中MAP3K3的表达情况,并分析其与卵巢癌临床病理因子的相关性以及预后的关系,探讨MAP3K3是否可以作为卵巢癌复发和预后判读的参考指标。结果:(1)MAP3K3蛋白表达主要位于细胞浆内,在卵巢癌和输卵管组织中均有表达,高表达率分别为59.1%(55/93)和30.3%(10/33),但在卵巢癌组织中的表达显著高于正常输卵管组织(p0.05);(2)MP3K3 mRNA在卵巢癌组织中的表达丰度显著高于正常输卵管组织(p0.01);(3)MAP3K3蛋白高表达与卵巢癌组织学类型(p = 0.001),组织学级别(p = 0.018),疾病发病模式((p = 0.000)以及化疗反应(p = 0.009)密切相关,与年龄(p=0.434),FIGO分期(p=0.491)以及腹水(p = 0.988)等临床病理参数没有统计学意义(p0.05);(4)应用Kaplan-Meier生存曲线分析发现高表达MAP3K3蛋白的卵巢癌患者无瘤生存期和总体生存期明显低于MAP3K3低表达患者(log-rank test,p= 0.007和p = 0.001);用Cox回归模型进行卵巢癌预后因素筛选发现,在包括年龄、组织学类型、组织学级别、发病模式、化疗反应、FIGO分期和腹水的多因素分析中,MAP3K3蛋白表达(HR:2.082,95%CI=1.154-3.756,p = 0.015)与年龄(HR:4.127,95%CI=1.178-14.461,p = 0.027)、化疗反应(HR:3.299,95%CI=1.473-7.387,p = 0.004)以及 FIGO 分期(HR:2.038,95%CI=1.083-3.834,p = 0.026)一样,是影响OC患者预后的独立危险因素。结论:(1)MAP3K3蛋白和mRNA在卵巢癌组织中高表达,且MAP3K3蛋白高表达与卵巢癌的组织学分级、发病模式、化疗反应等临床病理因子相关;(2)MAP3K3蛋白高表达的卵巢癌患者的无瘤生存期和总体生存期显著降低,是卵巢癌患者预后差的独立危险因素。第二部分MAP3K3介导NF-κB信号通路对卵巢癌生物学行为的影响目的:探讨MAP3K3对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭与转移等生物学行为的影响和可能介导的信号通路以及下游调控分子,为进一步阐明MAP3K3基因影响卵巢癌恶性生物学行为的分子机制奠定基础。方法:;采用Western Blot、荧光实时定量PCR和免疫荧光的方法检测6株卵巢癌细胞中MAP3K3的表达水平,分别用MAP3K3真核表达载体和MAP3K3特异性干扰表达载体转染内源性低表达和/或高表达MAP3K3的卵巢癌细胞系,构建MAP3K3稳定敲低细胞系和过表达细胞系;通过使用NF-κB信号通路特异性阻断剂QNZ和运用荧光素酶报告基因实验,观察处理前后NF-κB信号通路关键因子和EMT相关因子表达的变化情况,采用运用CCK-8方法检测干扰前后卵巢癌细胞增殖情况,克隆形成实验检测干扰前后细胞克隆形成情况,流式细胞术检测细胞凋亡,划痕实验和Transwell小室实验检测迁移和侵袭,免疫荧光检测EMT相关蛋白表达和细胞骨架蛋白表达的变化情况。结果:(1)在六株卵巢癌细胞中,MAP3K3的蛋白和mRNA在SKOV3、C13*和A2780中相对高表达,在HeyA8、OVCA433和OV2008中相对低表达。(2)MAP3K3表达下调能够阻抑TNF-α对NF-κB信号通路的激活效应,敲低MAP3K3后,NF-κB信号通路活性下降,间叶标记物N-cadherin、Vimentin和ICAM1的表达下调,上皮标记物E-cadherin表达上调,过表达MAP3K3后,上述现象逆转。(3)细胞内功能实验表明,敲低MAP3K3的表达能在体外抑制卵巢癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,并导致细胞自发凋亡增多,而过表达MAP3K3能够使上述现象逆转;在过表达MAP3K3的基础上阻断NF-κB信号通路后,卵巢癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力下降,细胞自发凋亡增多。结论:MAP3K3基因具有促进卵巢癌细胞增殖,抑制凋亡,增强卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力的功能;其机制可能是MAP3K3基因通过介导NF-κB信号传导通路,影响其下游的上皮间叶转化及细胞骨架蛋白表达,从而调控卵巢癌细胞的恶性生物学行为。


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