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BK通道α/β1亚基相互作用机制以及β2亚基胞外结构的研究

刘浩文  
【摘要】:离子通道是细胞膜上一类由特殊的大分子跨膜蛋白形成的孔道,这些孔道就是水溶性物质包括带电离子快速进出细胞的通道。BK通道又名大电导钙激活电压依赖的钾离子通道,在不同辅助亚基的调节下,在生命活动中扮演着极为重要的角色,不仅参与神经、肌肉、突触中的信号传递,还与多种遗传疾病密切相关。深入研究BK通道的门控机制、动力学特性以及结构功能,对进一步揭示其相关疾病的机理以及寻找有效的治疗方法具有重要的研究指导价值。本论文的研究内容主要由以下两部分构成:第一部分是通过电生理、分子动力学结构模拟等方法研究了 BK(β1)的通道特性,并进一步研究了其机制以及作用位点。结合了 β1亚基的BK通道表现出更强的钙敏感性,以及慢的去激活动力学特性。BK(β1)在平滑肌细胞中有着大量的表达,对血管平滑肌细胞的舒张和收缩有着重要的调控作用。在这一部分的研究中,我们的主要研究结果和结论如下:(1) 我们发现在β1亚基N端的氨基酸残基(E13, T14)可以与mSlo1 (α亚基)胞内的氨基酸残基(K392, R393)发生相互作用,形成增强钙敏感性的E(Calcium Enhancing)位点。(2)我们发现β1亚基N端疏水性的氨基酸(L5, V6, M7)可以与mSlo1胞内钙碗附近的疏水性氨基酸(L906, L908)发生相互作用。该位点不仅能调控钙敏感性,而且还参与调节镁敏感性,从根本上解决了之前一直困扰我们的β亚基究竟是怎样调控BK通道镁敏感性的难题。(3)基于以上的电生理实验结果给出的一些约束条件,我们用蛋白质同源建模软件模拟出了 BK (β1)复合体的结构。第二部分是通过结合膜片钳技术、分子生物学方法、分子动力学结构模拟研究了 BK通道β2亚基胞外loop区八个半胱氨酸二硫键的配对情况。BK通道及其β2亚基在嗜铬细胞和海马神经元有着大量的表达,BK(β2)通道具有快速的失活和慢的去激活动力学特性并且β2亚基的胞外loop区对BK通道的外向整流以及毒素的敏感性都具有重要的调节作用,从而调节神经冲动的传导。在这一部分的研究中,我们的主要研究结果和结论如下:(1)我们成功的辨别出了 β2亚基胞外loop区的八个半胱氨酸可以形成3对二硫键(C1::C5;C3::C7;C6::C8),剩下的两个半胱氨酸(C2, C4)由于空间上相距较远无法形成二硫键。(2)随后我们根据已有的电生理和生化实验的结果,建立了 β2亚基以及BK(β2)的分子动力学结构模型,从模拟结构上合理的解释了二硫键的形成机制,为β2亚基的蛋白纯化结晶以及结构解析提供了思路和方向。综上所述,本文旨在通过研究BK通道的特性,进而从功能和结构上来解释不同亚基的调控机制。


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