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两种基因型骨髓间充质干细胞(BMSCs)对LO_2肝细胞线粒体损伤保护作用的比较

皮阿黎  
【摘要】:背景和目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow–derived mesenchymal stem cells,BMSC)因其多向分化潜能、免疫调节功能及低免疫原等特性,成为最具治疗潜能的种子细胞。除慢性疾病以外,BMSC在急性炎症损伤中的保护作用也逐渐得到证实。肝细胞损伤是各型肝病共同病理基础,治疗及纠正肝细胞损伤是各型肝病治疗的主要措施。肝细胞富含线粒体,线粒体形态功能损伤进而导致肝细胞凋亡或坏死是肝细胞损伤发生发展的关键因素之一。近年来研究证实,BMSC对肝细胞损伤有治疗作用。值得注意的是BMSC在临床应用中存在移植率低,体内生存期短等缺点,如何优化BMSC,抑制其凋亡、促其增殖是增强BMSC疗效的关键。研究表明BMSC功能可受特异基因表达的调节。Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是最重要的病原模式识别受体之一,在先天免疫中发挥重要作用,且在BMSC表面高表达。有报道认为体外缺氧条件下TLR4会诱导BMSC凋亡、抑制其增殖,那么TLR4沉默能否促进BMSC的线粒体保护功能呢?据此,本文将首先分析TLR4对BMSC肝细胞线粒体保护功能的影响。BMSC通过直接接触或者旁分泌作用发挥保护机制,但BMSC移植后绝大部分被肺组织滞留、极少能到达肝脏,提示BMSC主要通过旁分泌方式保护肝细胞损伤。外泌体是细胞分泌的直径约为40-100nm的富含生物活性因子的膜型囊泡。外泌体被靶细胞识别、内化后可进而传递信息、调控靶细胞生物学功能。最新研究显示,BMSC亦可分泌外泌体,但BMSC外泌体在肝脏疾病中的治疗作用知之甚少,外泌体是否BMSC通过旁分泌途径保护肝细胞线粒体的关键媒介呢?需要特别提出的是,BMSC表面特异基因的表达亦可影响外泌体成分、调节外泌体功能。如前所述,TLR4可调节BMSC功能,那么TLR4可否影响BMSC外泌体功能进而调节其疗效呢?本文将进而探讨外泌体在BMSC线粒体保护功能中的媒介作用,并深入分析TLR4对外泌体该功能的影响。线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)是线粒体维持形态、发挥功能所必需的重要分子。近年来研究发现,Mfn2又是细胞内重要的信号转导分子,对细胞的生存发育能力非常重要,通过调控细胞增殖、分化、凋亡等复杂的信号转导参与多种病理生理过程。外泌体进入肝细胞后,是否通过与MFN2的相互作用介导对线粒体的保护呢?本文最后关注MFN2在外泌体行使线粒体保护功能中的介导作用。本文将以人胚胎肝细胞株L02为研究对象,LPS刺激L02为细胞损伤模型,比较野生型及TLR4 KO BMSC对受损LO2线粒体保护功能的差异,进而探讨各自外泌体在其中的关键媒介作用,最后分析其分子机制,为BMSC来源外泌体的临床应用及优化措施提供有价值的理论及实验依据。方法:首先用Transwell小室建立野生型BMSC(WT-BMSC)、TLR4 KO BMSC(TK-BMSC)分别与L02的非接触式共培养体系,组别设立如下:(1)LO2+PBS对照组;(2)LO2+LPS组(3)WT-BMSC+LO2+LPS组(4)TK-BMSC+LO2+LPS。检测不同组别L02细胞株线粒体的形态、线粒体膜电位、ATP产量、肝细胞内活性氧、肝细胞凋亡率来比较两种BMSC对线粒体损伤保护程度差异。然后在上述共培养体系中分别加入外泌体抑制剂预处理BMSC抑制外泌体分泌,重复上述线粒体形态和功能实验,分析BMSC对线粒体保护作用是否由外泌体来介导。继而提取野生型和TLR4 KO BMSC的外泌体,两种外泌体取代上述共培养体系中相应BMSC、分别与L02肝细胞共培养。用confocal检测外泌体与线粒体共定位并重复上述线粒体形态和功能实验,进一步证实BMSC外泌体在LO2损伤中的保护功能最后用qPCR和western检测上述共培养体系中L02细胞MFN2的mRNA和蛋白表达差异。进而构建MFN2过表达及knock down质粒,慢病毒转染调节共培养体系中L02细胞株MFN2表达,比较外泌体对MFN2 knock-down或过表达L02的保护作用是否削弱或增强从而证实BMSC外泌体对LO2线粒体保护经由MFN2介导。结果:(1)TLR4 KO BMSC对LPS损伤的L02线粒体保护作用强于野生型BMSC,具体表现为更完整的线粒体形态、增加的ATP产量和线粒体膜电位,减少的活性氧(ROS)含量和细胞凋亡率。(2)外泌体抑制剂处理后极大减弱了BMSC对受损L02线粒体的保护作用。(3)外泌体与LO2线粒体有共定位,且TLR4 KO-BMSC外泌体较野生型BMSC外泌体而言,对损伤L02粒体具有更强保护作用。(4)LPS刺激导致LO2细胞MFN2表达下降;BMSC外泌体抑制该下降,促进L02细胞中MFN2的基因和蛋白表达;敲降LO2 MFN2,明显削弱外泌体对LO2线粒体的保护作用,而过表达MFN2则增强外泌体介导的线粒体保护。结论:TLR4敲除使得骨髓间充质干细胞(BMSCs)对LPS刺激的L02肝细胞线粒体损伤的保护作用增强,该保护功能由BMSC分泌的外泌体介导,而外泌体经由线粒体外膜蛋白MFN2的介导实现其对线粒体形态功能的保护。


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