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氨氯地平通过激活血管平滑肌细胞中的Akt2/Sp1上调miR-21诱导血管舒张

方琴  
【摘要】:研究背景和目的2017年美国颁布新一版的高血压指南,将高血压重新定义为血压≥130mmHg和或舒张压≥80mmHg即称为高血压。这一举措体现了高血压早发现早干预的重要性。目前据统计,在全球范围内至少有15亿人患有高血压,它的发病是由环境因素和遗传因素共同决定的。但是,仍然有许多高血压患者存在耐药性,这些患者尽管使用三种或三种以上类型的抗高血压药物,血压仍不能很好的被控制。因此,阐明降压药物的详细机制并优化治疗策略显得尤为重要。CCB是经典的抗高血压药的一种,因为它们的降压效果较强大,常常作为治疗高血压的一线用药。此外,它还可以与其他抗高血压药物一起联合降压。目前,第三代L-型CCB系列,如氨氯地平,在治疗心脏和血管疾病方面显示出较大的优势。氨氯地平不仅可以降低血压,有文献报导它还可以减少心血管事件如抗动脉粥样硬化;减少冠状动脉疾病患者的住院治疗率。此外,氨氯地平已被发现是治疗高血压糖尿病患者血压波动性最有效的抗高血压药物。MicroRNAs(miRNAs)是一种小分子的内源性的非编码RNAs,它最经典的作用方式主要是通过靶定mRNAs的3′端非编码区(3′UTR)并与之结合,从而负向调节目标mRNA的表达,越来越多的文献证实它在基因调控中起着非常重要的作用。例如,miRNAs已经被证实在细胞代谢、分化、细胞表型转换、增殖、凋亡、机体的生长发育等一系列生理病理过程中扮演着至关重要的角色。自Minami等人报道阿托伐他汀可以调控miR-221/222的表达以来,他汀类药物调控许多其他种类的miRNA表达的例子也相继被证实。例如,他汀类药物可以上调miR-33b的表达,随后抑制人的c-Myc的表达和功能。他汀类药物可以抑制血管内皮中的MiR-133a的表达,从而阻止内皮功能障碍。洛伐他汀诱导的miR-29b可降低高血糖,调控血脂异常和减轻高同型半胱氨酸血症大鼠的氧化应激的水平。目前尚不清楚miR-21是否受抗高血压药物的调节。本研究的目的是探讨抗高血压药物对miR-21表达的影响并探讨其可能的调控机制。实验方法及实验结果1.首先,我们购买了6周龄的雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY)和自发性高血压大鼠(SHR)适应一周后,我们分别给予不用种类的降压药干预10周,通过real time PCR检测血浆和主动脉组织中miR-21的表达水平。实验结果表明6种降压药中,只有氨氯地平既可以显著上调血浆中的miR-21的表达水平又可以明显上调主动脉组织中的miR-21的表达水平。我们还发现吲达帕胺可以上调主动脉组织中的miR-21的水平而对血浆中的miR-21没有明显的影响。其次,通过western blot,我们还发现氨氯地平可以明显逆转高血压引起的主动脉VSMC表型转换,即升高VSMC收缩型标志物α-SMA、CNN1和SMMHC,降低分泌型标志物OPN的表达。而吲达帕胺却并未观察到类似的效应。再次,我们还在用苯肾上腺素(PE)模拟的细胞高血压模型中观察到了氨氯地平所发挥的与在动物模型上相一致的效应。此外,在正常环境下,我们还发现氨氯地平仍然可以调控VSMC的分化,并且这种调控与氨氯地平的浓度和干预的时间是呈依赖性的。2.为了探究氨氯地平上调的miR-21在其调控VSMC分化中有无作用,我们设计了miR-21的TUD序列,通过与miR-21紧密结合抑制其表达。我们将上述的TUD序列插入到重组腺相关病毒的表达载体上,并运用钙磷3质粒共转染的方法包装成病毒。然后再进行纯化,测病毒滴度,检测合格后再通过大鼠尾静脉注射的方式将病毒输送到模型鼠的体内。此次,我们仍然选择了6周龄的雄性WKY大鼠和SHR作为模型鼠。病毒注射3周后,我们开始用氨氯地平灌胃给药4周。通过real time PCR检测主动脉组织中miR-21的表达水平发现rAAV-miR-21-TUD病毒可以显著下调主动脉组织中miR-21的表达水平。免疫荧光显示我们的病毒作用的靶细胞类型是血管平滑肌细胞。Western blot结果显示,rAAV-miR-21-TUD明显逆转了氨氯地平上调α-SMA、CNN1和SMMHC的表达和下调OPN的表达。在体外实验中,我们运用miR-21inhibitor干预VSMCs得出了与动物模型相一致的结论。另外,我们运用miR-21 mimics过表达miR-21发现它可以明显增加VSMC收缩型标记物α-SMA、CNN1、SMMHC的表达和降低分泌型标志物OPN的表达。免疫荧光染色进一步证实了以上的结论。PDCD4和PTEN是miR-21调控血管平滑肌功能比较经典的两个作用靶点。我们运用Western blot的方法发现氨氯地平可以明显抑制PDCD4的表达而对PTEN的表达没有影响,并且氨氯地平对PDCD4的抑制作用是与它上调miR-21的表达相一致的。因此,我们认为氨氯地平调控VSMC的分化可能是通过上调miR-21靶向PDCD4来实现的。3.为了进一步探索氨氯地平调控miR-21的机制,我们研究了miR-21上游的转录调控区域,试图找出潜在的转录因子。理论上这些转录因子既要可以激活miR-21的表达,也能够参与VSMC表型转换。我们运用生物信息学的方法分析了可能调控miR-21表达的转录因子,共发现62个可能的转录因子。参考目前已发表的研究,发现15个与VSMC表型转换相关的转录因子。通过取二者的交集我们将可能的转录因子缩小至7个包括NFAT5,Klf4,Klf5,CREB3,TBP,Sp1和TRB3。接着,我们将目标锁定在这7个转录因子上,我们运用real time PCR发现在这几种转录因子中氨氯地平干预仅仅显著增加Sp1的表达而对其他转录因子无作用。与miR-21类似,氨氯地平以剂量和时间依赖性方式诱导Sp1表达,并且在整体研究和体外研究中观察到的结果是一致的。我们还检测了Sp1在氨氯地平诱导的VSMC分化过程中所起的作用。Western blot显示,Sp1特异性小干扰RNA可以明显降低氨氯地平诱导的α-SMA,CNN1和SM-MHC蛋白水平的增加以及氨氯地平诱导的VSMC中OPN蛋白水平的降低,而运用Sp1的过表达质粒pcDNA3.1-Sp1则显示出相反的效果。Real time PCR和双荧光素酶测定结果显示,Sp1的siRNA能够显著减低氨氯地平诱导的VSMCs和HEK293T细胞中miR-21表达的增加,而pcDNA3.1-Sp1则表现出相反的效果。为了探究Sp1和miR-21之间的具体的结合位点,我们将miR-21启动子区域分成四个片段(-2173/+66,-1398/+66,-781/+66和-383/+66),并将它们分别克隆到pGL3荧光素酶报告基因载体上。荧光素酶报告基因的结果显示氨氯地平增加了-2173/+66-bp区域片段的荧光强度,而对其他三个区域片段的荧光强度没有变化。随后,通过生物学信息预测了Sp1与miR-21结合的两个潜在位点,即-2034/-2027和-1986/-1978。我们对此设计了一系列缺失突变位点,实验结果显示氨氯地平可以显著上调-1986/-1978突变片段的荧光值而对-2034/-2027突变片段不起作用,这说明最强大的作用是由-2034/-2027区域介导的,而不是-1986/-1978区域。此外,我们运用ChIP-qPCR和EMSA这两项实验进一步证明了Sp1与miR-21的结合位点-2034/-2027区域的调节作用。4.以前的研究证实,氨氯地平可以显著增加SHR主动脉中p-Akt(S473)的表达。因此,我们探究了氨氯地平对VSMC中p-Akt(S473)表达是否有影响。我们在体外运用PE模拟细胞高血压状态,western blot结果显示氨氯地平以浓度和时间依赖性方式诱导p-Akt(S473)的表达。在正常环境下,我们观察到与之前相一致的结果。使用小干扰RNA抑制Akt2的表达,但不影响Akt1或Akt3的表达,明显抑制了氨氯地平诱导的α-SMA、CNN1和SM-MHC上调以及氨氯地平诱导的OPN下调,而过表达Akt2则呈现相反的效果。但是,当我们分别用小干扰RNA抑制Akt1或Akt3的表达时,却对氨氯地平的作用没有影响。此外,western blot结果显示氨氯地平增加Akt2磷酸化(Ser474)并以时间依赖性方式促进其核转位,而对Akt3磷酸化(Ser472)没有影响。Real time PCR和双荧光素酶实验结果表明,特异性的敲低Akt2明显减弱氨氯地平诱导的VSMCs和HEK293T细胞中miR-21表达的增加,而Akt2的过表达质粒pcDNA3.1-Akt2则表现出相反的效果。此外,当我们特异性的敲低Akt3的表达时,却并不能影响氨氯地平诱导的VSMCs和HEK293T细胞中miR-21表达。5.为了进一步揭示Sp1是否与Akt2存在着某种联系,我们又进一步的在体外的细胞实验中进行了验证。在VSMC中,我们运用Akt2的小干扰RNA,特异性的敲低Akt2的表达,观察是否会影响氨氯地平对Sp1表达的调控。实验结果显示氨氯地平诱导的Sp1表达被Akt2的siRNA降低,但当把Akt1或Akt3敲低时,Sp1的表达却并不受影响。反过来,我们运用Sp1的小干扰RNA,特异性的敲低Sp1的表达,观察是否会影响氨氯地平对Akt2表达和磷酸化的调控。结果显示,Akt2和Akt2磷酸化水平不受Sp1 siRNA的影响。但是当我们运用Akt2的过表达质粒pcDNA3.1-Akt2外源的增加Akt2时,结果显示Sp1的蛋白水平是增加的。结果说明,氨氯地平诱导的Sp1的表达受Akt2的调控。此外,我们还运用flag标签分别标记Sp1和Akt2的过表达载体pENTER,分别转染pcDNA3.1-Akt2或pcDNA3.1-Akt2和flag-pENTER-Sp1(pcDNA3.1-Sp1或pcDNA3.1-Sp1和flag-pENTER-Akt2)进VSMC,并进行免疫共沉淀检测,结果显示Sp1和Akt2和p-Akt(S474)可能通过直接结合的方式相互作用。此外在氨氯地平干预后,我们通过设置不同的时间梯度,然后运用亚细胞结构提取试剂盒将胞浆胞核分开,分别检测p-Akt2(S474),Akt2和Sp1表达。实验结果显示p-Akt2(S474),Akt2和Sp1在细胞核中呈增加趋势而在细胞质中随时间逐渐减少。通过将Akt2沉默和过表达,观察Sp1在细胞核中的变化,我们发现Sp1在细胞核中的减少或增加依赖于Akt2表达的减少和增加。我们接下来还运用PI3K抑制剂LY294002,观察它是否对Sp1表达产生影响。Western blot结果分析显示LY294002(50μM)明显降低了细胞核中的Sp1表达。总之,这些数据显示氨氯地平增加了细胞核中的磷酸化Akt2,从而诱导Sp1从细胞质转位至细胞核。实验结论:通过本实验研究我们发现,氨氯地平通过激活Akt2和上调主动脉VSMC细胞核中的Sp1表达来增加miR-21的表达,miR-21通过靶向PDCD4以促进分化基因的表达。本研究为氨氯地平调控VSMC表型转换的机制提供了新的思路,这些发现为基于miRNA的高血压等相关疾病的治疗提供了理论基础。


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1 方琴;氨氯地平通过激活血管平滑肌细胞中的Akt2/Sp1上调miR-21诱导血管舒张[D];华中科技大学;2019年
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