环保仿生型抗菌剂对生物膜下微生物腐蚀作用机制

【摘要】：微生物腐蚀(MIC)是工业生产过程中主要的腐蚀类型之一,其中硫酸盐还原菌(SRB)存在最为普遍。SRB通过新陈代谢活动在各种材料表面形成生物膜,造成物理、化学等灭菌手段失效,严重威胁材料服役安全。目前,工业上普遍采用投加化学杀菌剂的方法控制SRB生长,以减缓金属腐蚀。但由于生物膜对膜内细菌的保护作用,导致膜内细菌长期与低浓度杀菌剂接触,产生耐药性,导致化学类杀菌剂投加量逐年增加。大量化学抗菌剂的使用不仅增加处理成本,且易引起环境二次污染问题。因此本课题研发低毒高效环保的抗菌剂,破坏生物膜的天然屏障作用,从而达到抑制生物膜下微生物腐蚀的目的,选题具有重要的理论和实际意义。1.寻求抗菌、缓蚀双功能杀菌剂来减少化学药剂添加量,利用小分子杀菌剂破坏生物膜、渗透进生物膜中杀灭SRB菌,同时固定生物膜,充分利用灭活生物膜的机械隔离作用减轻腐蚀。系统研究了吡啶硫酮钠(SPT)在油田模拟水中的抗菌效果和抗微生物腐蚀性能。菌量测试表明,30 mg/L的SPT能使游离和固着SRB细胞降低4-5个数量级,而80mg/L的SPT可以完全杀灭SRB细胞。SPT作为低毒高效的杀菌剂可以抑制SRB在试片表面的生长代谢,由此试片表面细胞、生物膜和腐蚀产物等随着SPT浓度增加而减少,进而导致膜下腐蚀减轻。80 mg/L SPT条件下,腐蚀失重抑制率达到82%。SPT通过持续性的离子转移,导致细胞内外形成跨膜驱动力,使细胞坍塌死亡,而自身很少被消耗,由此导致抗菌具有长效性。热力学和量子化学研究显示,SPT可以取代金属表面水分子,为Fe原子d轨道提供电子并形成共价键,通过物理吸附和化学吸附在碳钢表面形成吸附膜,并与固化的生物膜等共同起到隔离作用,减轻腐蚀发生。2.师法自然,人工合成具有广谱抗菌性能的线性抗菌肽,应用于SRB腐蚀领域,减少大量化学药剂二次污染的同时,防止耐药菌的产生,提出更生态前沿的新思路。采用Fmoc固相合成技术人工合成阳离子抗菌肽库,并从中筛选出具有抗SRB性能的阳离子肽。结果表明,KWRKWWKRFK序列的阳离子抗菌肽抑制SRB效果最优,80 mg/L的阳离子抗菌肽可以降低游离和固着细胞1-2个数量级,而160 mg/L完全抑制了游离和固着SRB细胞生长。SRB在试片表面激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)测试与菌量结果相一致,证明了抗菌肽对SRB有良好的抑制作用。160 mg/L的抗菌肽失重抑制率可以达到88%,非均匀腐蚀也明显减轻,表明抗菌肽可以同时抑制SRB的均匀腐蚀和局部腐蚀。特殊的电荷分布和疏水残基分布是抗菌肽性能优异的原因,合成的抗菌肽通过吸附于SRB细胞表面,破坏细胞膜结构,使得细胞质流出,导致细胞死亡,死亡的细胞和生物膜附着在金属表面形成保护膜进一步减轻X80钢的腐蚀。3.为了降低生物肽的使用成本,提升合成肽的活性,对线性肽进行空间结构改性,改性后的环状肽能以极低的加入量增效杀菌剂,大大降低化学药剂用量。系统研究了端基封闭的Peptide A与杀菌剂四羟甲基硫酸磷(THPS)协同作用下MIC腐蚀机制。结果表明20 mg/L THPS单独作用时抗菌效果并不明显,在此基础上加入10μg/L和100μg/L的Peptide A后,虽然游离细胞数几乎不变,但固着细胞数明显降低2-4个数量级,揭示了Peptide A不是直接作为杀菌剂杀灭细胞,而是驱散金属上附着的生物膜。腐蚀失重结果中,100μg/L的Peptide A腐蚀抑制率达到83%,非均匀腐蚀也明显降低。说明这种具有空间环状结构的生物活性肽Peptide A比线性结构的肽性能更优,Peptide A通过增效THPS阻断细胞附着、驱散生物膜,使细胞和金属间的电子传递过程被阻断,进而减轻腐蚀。20 mg/L THPS+100μg/L Peptide A的微生物腐蚀抑制率与50 mg/L THPS相当,起到了药半功倍的效果。4.在生物肽研究基础上,使用可以产生类抗菌肽活性物质的有益菌,原位培养,与腐蚀菌群SRB竞争生长,原位产生抗菌物质抑制SRB生长和腐蚀。选择与SRB具有相似生长环境的枯草芽孢杆菌为目标菌,研究其与SRB共同培养、竞争生长时,SRB生长规律和X80钢表面微生物腐蚀行为。菌量测试表明混合菌中SRB游离和固着细胞数分别下降4和5个数量级,主要归因于枯草芽孢杆菌代谢过程产生的大量抗生素和抗菌多肽类化合物,这些抗菌代谢物有效抑制了SRB的生长。腐蚀失重结果显示混合菌条件下腐蚀抑制率高达94%,腐蚀电流密度计算得到的腐蚀抑制率也达到92%,与失重结果基本一致,进一步证明了混合菌条件下可以通过生物竞争、原位产生代谢产物的方式使X80钢腐蚀减轻。