基因枪法介导Pina和Pinb基因转化硬粒小麦的研究

【摘要】：小麦籽粒硬度是决定小麦磨粉品质和食品加工品质的重要因素之一,它与Puroindoline a (PINA)和Puroindoline b (PINB)蛋白直接相关。PINA和PINB蛋白分别由5DS上的两个连锁基因Pina和Pinb编码;Pina缺失或Pinb发生突变均导致小麦籽粒质地由软质变为硬质。本论文以4种硬粒小麦(Triticum turgidum L. var. durum)品种Luna、Ofanto、Venusia和Latino×Lira为试验受体材料,应用基因枪转化法,将野生型Pina和Pinb基因转入不含有这两个基因的硬粒小麦中,取得如下结果。 1)挽救陈年小麦种质资源方法的建立。以2种普通小麦(Triticum aestivum L.)品种湘83-2661、襄麦5号和4种硬粒小麦(Triticum turgidum L. var. durum)品种Luna、Ofanto、Venusia和Latino×Lira离体成熟胚为外植体材料,应用MS基本培养基附加2,4-D、NAA 、KT、6-BA、GA3进行培养,试验采用单因子和正交设计的方法。结果表明,GA3对离体成熟胚的萌发有显著促进作用,单独使用2.5mg/L GA3和组合使用2.0mg/L 2,4-D + 1.1mg/L NAA + 0.5mg/L 6-BA + 4.0mg/L GA3能使将离体成熟胚萌发率提高29.2-32.5%。 2)大肠杆菌的质粒转化和质粒大量抽提及纯化方法的优化。采用优化后的方案,分别将质粒pCaI-Neo、pUbiPina和pUbiPinb转化到大肠杆菌菌株XL1-Blue中,对3种质粒进行大量制备及纯化的结果表明,制备的质粒为目的质粒且纯度和产量均较高。 3)以GUS瞬时表达研究并优化了基因枪的轰击条件,结果显示900Psi轰击压力和6cm轰击距离为合适的轰击参数。采用优化后的轰击方案,以4种硬粒小麦Luna、Ofanto、Venusia和Latino×Lira的幼胚盾片为外植体,将携带有外源目的基因Pina、Pinb和选择基因Neo的质粒pUbiPina、 pUbiPinb和pCaI-Neo共转化到受体材料中,统计结果显示轰击后的4种外植体材料的愈伤组织诱导率分别为99.4%、100.0%、95.2%和97.0%。