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藻胆蛋白裂合酶性质及催化功能研究

武栋  
【摘要】:藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族。藻胆色素生物合成的最后一步为色素与脱辅基藻胆蛋白的连接。体内,藻胆色素的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。目前已知藻红蓝蛋白裂合酶PecE/F 催化藻蓝色素PCB 异构化形成PVB 并与脱辅基蛋白PecA 连接; 藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F 催化藻蓝色素PCB 与脱辅基蛋白CpcA 的连接。PecE/F 与CpcE/F 之间有20~40%的相似性,对这两个酶的催化机理的研究还是空白。本研究通过比较两者的氨基酸序列,构建缺失突变体、定点突变体和使用化学修饰的方法对其功能区域及功能氨基酸残基进行分析。 首次研究了PecE 和PecF 催化反应中的辅助因子和酶动力学。研究表明:巯基乙醇(5mmol/L)和Mg2+(5mmol/L)、Mn2+(3mmol/L)是催化反应所必需的,1%Triton X-100 可提高反应效率。磷酸钾和Tris 混合缓冲液可以提高蛋白的溶解性和减少其对金属离子的的结合,有利于催化反应。酶动力学研究表明催化反应遵循顺序反应机制,在催化反应中:PecE 主要催化PCB 与脱辅基蛋白的连接,PecF 主要催化色素PCB 异构化形成藻紫胆素PVB。PCB 与脱辅基蛋白PecA 在无酶催化下形成共价连接产物:31-Cys-PecA-PCB,但不能作为PecE/F 的底物被催化形成正确的产物:31-Cys-PVB-PecA。利用镍离子鳌合亲和层析提纯,证明PecE 和PecF 之间可形成复合物。 在序列分析和实验室已经研究的PecE/F 缺失突变体的基础上,构建了缺失突变体PecE(1-267)和PecF(57-212),前者酶活性无变化,PecF(57-212)的研究表明PecF中4 个独特的连续组氨酸残基对酶活性没有贡献。PecE 和PecF 中4 个高同源性的半胱氨酸残基进行了定点突变,研究了突变体PecE(C48Q)、PecE(C91L)、PecE(C161L)和PecF(C122L)在三种不同状态(未提纯,提纯,尿素变性复性)下的酶活性。酶动力学研究表明:PecE 的第48 位半胱氨酸残基与底物结合有关,第91 位半胱氨酸残基参与酶催化和底物结合; PecF 第122 位半胱氨酸残基位于酶活性中心,对它的突变导致了酶活性丧失。PecE 和PecF 都可以与底物PCB 结合,半胱氨酸残基的突变导致了PecE 突变体结合PCB 能力的下降和PecF(C122L)光谱的红移。PecE/F 与PCB的结合在紫外光激发下显示荧光,在尿素变性条件下吸收光谱范围在550~660 nm 之


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