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紫杉醇及紫杉烷的积累规律与代谢谱研究及其应用

赵春芳  
【摘要】:紫杉烷是以抗癌药物紫杉醇为首的、具有五甲基十五碳烯骨架的一类二萜类化合物的总称,其中有些紫杉烷可作为半合成紫杉醇的原料,有些具有多方面的药理活性。紫杉烷化学合成困难,大规模培养植物细胞和种植红豆杉,是获得紫杉醇和其它重要紫杉烷的可行途径,但目前面临着产量不稳定的问题。深刻认识紫杉醇的生物合成机制,通过遗传改造对植物或细胞实施代谢工程是解决这一问题的根本出路。本论文主要从紫杉烷类物质的积累规律和代谢轮廓分析的侧面切入到紫杉醇的生物合成的研究主题。通过构建中国红豆杉植物和细胞提取物中紫杉烷的代谢特征图谱, 利用液质联用方法鉴定谱图中的组分,结合不同的生态条件调查和诱导手段,试图从植物代谢组学的观点和角度研究紫杉烷的生物合成、代谢和积累的规律,在此基础上,探讨可持续性的利用红豆杉资源提高紫杉醇及有药用价值的紫杉烷产量的新技术、新途径。 首先研究红豆杉植物或细胞样中微量紫杉烷的精确检测方法。发现用甲醇浸提,固相萃取( SPE)方法制样,以乙腈-甲醇-水三元流动相等度洗脱和C18 柱反相色谱体系、检测波长为227nm,对紫杉醇、10-去乙酰巴卡亭III 、巴卡亭III 、巴卡亭VI 和1-乙酰-5,7,10-去乙酰巴卡亭I 等5 种紫杉烷同时检测,最低检测限为0.5~4.5 mg/L,紫杉醇在2.0~180 mg/L (r= 0.9993)、10-DAB 在2.0~166.0 mg/L (r=0.9975)、B III 在6 ~170 mg/L (r=0.9937)、B-VI 在7.0~200.0 mg/L(r=0.9921)、DAB-I 在1.0~130 mg/L (r=0.9945)范围内具有良好的线性关系; 紫杉醇回收率为98%±1.5%,日内RSD 为1.8%,日间RSD 为2.5%。在此基础上,经固定提取和粗分离方法,获得了植物和细胞样中紫杉醇极性相关的一组紫杉烷的HPLC 色谱图,并通过了稳定性、精密性等方法学验证; 接着,进一步探讨了利用特征图谱对不同品种、不同植物组织部位的紫杉烷化学组进行动态分析的方法。 利用液质联用确定了中国红豆杉细胞培养物所产生的主要紫杉烷。通过遗传相关性和广泛的文献查阅,可以确定分子结构的有Taxuyunnanine C 及其C14位丙酰和异戊酰取代衍生物,和yunnanxane、taxol、B III、DAB-I、B-VI 等8种紫杉烷,另外5个化合物获得了分子量信息,并根据质谱裂解规律归属了它们分子结构类型、取代基种类和数量,提出了可能的分子结构式。


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