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内皮素受体B多态性与SOX10表达在先天性巨结肠症发病机制中作用研究

牛彦锋  
【摘要】: 第一部分散发性先天性巨结肠症内皮素受体B基因多态性与突变的筛检 【目的】筛检内皮素受体B易感基因在中国汉族散发性先天性巨结肠症是否有突变与多态性,探讨EDNRB与先天性巨结肠症发病的关系。 【方法】采用病例对照研究方法,收集104例散发性先天性巨结肠症外周血标本,120例正常儿童作对照。盐析法提取全部样本DNA,聚合酶链反应扩增内皮素受体B的7个外显子与内外显子交界区片段,单链构象多态性方法筛检异常泳动条带来判断突变与多态性。 【结果】散发性先天性巨结肠症EDNRB基因外显子1,3,4,6和7均检测到突变或多态性位点,突变以短段型为主,而外显子2和5无此异常改变。 【结论】中国汉族散发性先天性巨结肠症发病与内皮素受体B密切相关,尤其短段型HD,多态性位点与突变可能影响受体功能。 第二部分散发性先天性巨结肠症内皮素受体B基因多态及突变类型的确定与分布 【目的】研究中国汉族散发性先天性巨结肠症易感基因内皮素受体B突变与多态性特征,探讨不同碱基改变与先天性巨结肠症的发病关系。 【方法】收集104例散发性先天性巨结肠症外周血标本,以120例正常儿童作对照。盐析法提取全部样本DNA,采用聚合酶链反应扩增易感基因内皮素受体B的7个外显子与内外显子交界区片段,单链构象多态性方法筛检异常泳动条带后,DNA直接测序确定突变与多态性位点,比较病例组与对照组多态性位点的等位基因频率及基因型分布差异。 【结果】散发性先天性巨结肠症患者EDNRB基因突变率为6.7%(7/104),4种突变方式,新发现突变点为c711 C>A(2例)与c1157 T>G(2例),c723 T>C(2例)与c1278 T>C(1例)为已报道突变点,分别位于外显子3,6和7,6例为短段型,突变均为杂合体;共检测5个多态性位点,除c99 C>T(P33P)外,c311 A>T(N104I)、c831 G>A(L277L)、c1148 C>A(P383Q)及c1170 C>A(S390R)四个位点的等位基因频率与基因型分布均差异显著(P<0.05),其中c1148 C>A位点携带CC基因型的羁患风险高达8.2倍(95%CI3.1~21.7,P<0.001)。 【结论】中国汉族散发性先天性巨结肠症易感基因内皮素受体B存在多种突变方式,以短段型为主且均为杂合体突变,突变与临床表型存在异质性;内皮素受体B基因可检测到5个多态性位点,4个SNPs的等位基因频率和基因型分布频率在病例与对照组间差异显著,与HD发病有明显相关性,SNPs位点可用于评估羁患风险;不同种族sHD的EDNRB基因遗传特征存在差异。 第三部分散发性先天性巨结肠症内皮素受体B基因多态性及突变与双亲遗传关系及HD易感性的研究 【目的】研究中国汉族散发性先天性巨结肠症亲子代间EDNRB基因突变与多态性的遗传特征,并评估单体型与羁患风险的关系。 【方法】收集104例散发性先天性巨结肠与其中42例患儿的双亲血样,以120例正常儿童作对照,通过PCR-SSCP与DNA测序确定并比较EDNRB基因的突变与多态性位点基因型与等位基因分布差异,以传递不平衡检验(TDT)分析42个三样本家系SNPs的传递不平衡,并分析sHD表型与SNPs的关联;以单体型遗传模式确定羁患风险。 【结果】sHD患儿EDNRB基因突变率6.7%(7/104),3例属种系突变,其中2例突变基因遗传自未发病母亲;检测发现5个cSNPs位点,TDT检验发现亲子代在c311 A>T和c1148 C>A两个非同义SNP位点存在传递不平衡,患儿易感等位基因T(c311 A>T)、C(c1148 C>A)频率明显比双亲高(P<0.01);SSA型在4个SNP位点与正常对照差异显著,LSA型仅1个位点,并且SSA型在c831G>A与c1170 C>A位点的等位基因频率与LSA型差异显著(P<0.05);c311 A>T与c1148 C>A两个多态性之间存在连锁不平衡,病例组单体型311A-1148A频率明显低于对照组(2.9%vs 16.7%,P<0.01),提示此单体型对sHD具有保护作用,单体型311T-1148C频率明显高于对照组(18.8%vs 7.9%,P<0.01);与携带311A-1148A单体型基因型(311A-1148A/311A-1148C,311A-1148A/311A-1148A,311A-1148A/311T-1148C)比较,非311A-1148A单体型携带者羁患sHD的风险增加到8.2倍(OR=8.153,95%CI:3.057~21.741,P<0.001)。 【结论】中国汉族人群散发性先天性巨结肠症EDNRB基因突变以种系突变为主;sHD易感基因EDNRB存在5个多态性位点,c311 A>T和c1148 C>A两个SNPs位点亲子代间存在传递不平衡,易感等位基因优先传递;sHD的SSA表型比LSA表型与EDNRB基因的关联性明显;单体型311A-1148A能降低发病风险,具有保护作用,非311A-1148A单体型携带者羁患sHD的风险增加到8.2倍(OR=8.153,95%CI:3.057~21.741,P<0.001)。 第四部分SOX10候选基因与散发性先天性巨结肠症相关性的研究 【目的】研究性别决定区Y基因相关高可变区基因10(SOX10)在散发性先天性巨结肠(sHD)组织中表达情况,分子基础上探讨SOX10在sHD发病机制中作用。 【方法】收集55例散发性先天性巨结肠手术标本,以24例非HD的正常肠管作对照,通过半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测SOX10 mRNA在不同病变肠管的转录水平,并分析其与临床参数的关系。 【结果】SOX10在sHD病变肠管与正常对照肠管的组织均有表达,狭窄段表达水平为(0.766±0.038),明显低于移行段(0.834±0.034)、扩张段(0.829±0.030)及正常对照组(0.824±0.021)的表达(P<0.01),而移行段、扩张段及正常对照间无统计学差异(P>0.05);短段型狭窄段表达明显高于长段型((0.775±0.037)vs(0.752±0.036),P<0.05)。 【结论】SOX10基因表达异常与散发性先天性巨结肠症发病相关,尤其与长段型更密切;SOX10可能是出生后肠神经系统维持正常功能所必须。


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