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富集纯化母血中胎儿有核红细胞并利用胎儿有核红细胞进行胎儿非整倍体的无创性产前诊断

徐晓燕  
【摘要】: 目的利用显微操作术和流式细胞术分离富集母血中的胎儿有核红细胞(FNRBCs),通过对富集方法的比较,探讨分选胎儿细胞的最适方法。 方法收集120例孕周为10-32周的孕妇外周血,密度梯度离心分离出单个核细胞层,分为2等分,分别用显微操作和三种抗体流式分选富集胎儿有核红细胞(FNRBCs),后者每例标本分为5组,分别加入不同抗体:第1组.抗转铁蛋白受体抗体(CD71McAb)单用;第2组.单克隆抗血型糖蛋白A抗体(GPAMcAb)单用;第3组.抗血红蛋白-ζ抗体(ζ-Hb)单用;第4组.CD71+GPA联用;第5组.CD71+GPA+ζ-Hb联用。最后应用PCR技术检测分选后的FNRBCs的SRY基因,计算鉴定细胞的符合率。 结果密度梯度离心后显微操作分离到的NRBCs有97例,各有1-11个NRBCs,占80.83%,鉴定细胞符合率61.7%;五组FNRBC的阳性细胞检出率和鉴定细胞符合率分别为:2.8%,70.8%;5.74%,65.5%;0.25%,95.8%;0.74%,95..8%;0.02%,43.3%。流式细胞术后利用显微操作术,每例标本均可得到FNRBCs3-15个,细胞鉴定符合率82.5%。 结论:流式细胞术结合显微操作法可得到到高纯度的FNRBCs,为后续的产前诊断打下良好的基础。 第二部分鉴定胎儿细胞及母血中游离胎儿DNA 目的通过用不同方法鉴定胎儿细胞及胎儿游离DNA,比较各种方法的优缺点,探讨这几种方法的适用性。 方法收集175例孕龄为10-33周孕妇外周血8ml,其中7.5ml血用流氏细胞术结合显微操作术提取单个胎儿细胞,另外0.5ml全血提取游离DNA。将每例标本分为3组:1组利用巢式PCR扩增单个FNRBC的SRY基因;2组利用PRINS技术检测单个FNRBC中的Y染色体;3组利用荧光定量PCR扩增母血中游离胎儿DNA中的SRY基因。 结果1.利用巢式PCR扩增出单个FNRBC的SRY基因82例,阳性准确率91.1%(82/90);2.QF-PCR可以扩增出母血胎儿游离DNA中SRY基因90例,阳性准确率100%(90/90);3.利用PRINS技术检测出Y染色体90例,其中假阳性1例,阳性准确率98.9%(89/90)。 结论PRINS和QF-PCR是准确性高,特意性强的方法,可用于胎儿细胞及胎儿游离DNA的鉴定。 第三部分利用孕妇外周血进行无创性产前诊断胎儿非整倍体 实验一通过检测孕妇外周血清中的AFP,β-HCG和μE3含量进行胎儿先天愚型的筛查 目的探讨采用甲胎蛋白(AFP),绒毛膜促性腺激素β亚单位(Freeβ-HCG),游离雌三醇(μE3)血清三联法在染色体异常为主的先天性缺陷的产前筛查作用。 方法对2003年8月至2005年8月来我院妇产科门诊进行产前检查的孕妇278例,在知情情况下,自愿选择唐氏血清标记筛查。采用酶联免疫法测定上述3项指标,并结合孕妇临床资料,用唐氏筛查风险软件进行分析。最后随访追踪每例筛选的孕妇至胎儿出生。 结果278例孕妇中,高危人群25例,占总数的8.9%。异常胎儿2例,其中21三体1例,死胎1例。并发现唐氏征高风险的孕妇伴有妊娠并发症10例。结论对胎儿先天性缺陷,特别是染色体异常的胎儿产前筛查是重要的手段之一。产前筛查可降低围产儿死亡率,降低出生缺陷率。它具有重要的社会效应和实用性,可普遍推广使用。 实验二利用孕妇血中的胎儿有核红细胞诊断胎儿非整倍体 目的探索用孕妇外周血中的胎儿细胞进行无创性诊断胎儿非整倍体的新方法。 方法取实验一中唐氏筛查高危孕妇和到本实验室自愿要求检查的孕12-32周孕妇的肘前静脉血,共112例。密度梯度离心后取单个核细胞层,采用流式细胞术从112例孕妇外周血中分离出FNRBCs,应用多重引物原位合成技术(PRINS)分别检测FNRBCs内的X、Y及21号染色体。 结果112例标本中每例都可以检测出X染色体,敏感性和特异性均为100%;检测出Y染色体69例,敏感性92%(69/75),特异性为100%(69/69),检测出Klinefelter(XXY)综合征2例,Down's(21三体)综合征2例。 结论应用PRINS技术对孕妇外周血中的胎儿细胞进行无创性产前诊断胎儿非整倍体是一种快速、敏感性高、特异性强的新方法,具有应用于临床的前景与价值


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