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胎盘生长因子及其受体Flt-1与妊娠期高血压疾病发病及一氧化氮关系的研究

沈红玲  
【摘要】: 胎盘生长因子及其受体Flt-1与妊娠期高血压疾病发病及一氧化氮关系的研究 胎盘生长因子(PLGF)最初从人类胎盘组织cDNA库中分离,属于血管内皮生长因子(VEGF)家族中一个新成员。与VEGF广泛分布不同,PLGF主要局限于胎盘部位表达,尤其是孕晚期胎盘。因而,PLGF对滋养细胞和内皮细胞功能有独特的调节作用,目前已成为研究热点。 妊娠期高血压疾病(HDCP)是妊娠期特有的疾病,是孕产妇和围生儿病率及死亡率的主要原因。HDCP确切发病原因不明。目前普遍认为其发生可能与胎盘浅着床、胎盘血管网络发育不良、胎盘缺血缺氧有关。PLGF主要由滋养细胞和血管内皮细胞分泌,其特异性结合的酪氨酸激酶受体(Flt-1)位于血管内皮细胞和滋养细胞,故PLGF对血管生成和滋养细胞浸润有重要的旁分泌和自分泌作用,推测PLGF及其受体的表达异常可能与HDCP发病有关。但目前有关PLGF及Flt-1在HDCP胎盘局部的报道尚少。 一氧化氮(NO)是血管内皮源性舒张因子,在调节胎儿胎盘循环中起重要作用。既往研究已证实NO分泌减少与HDCP发病存在密切关系。VEGF与Flt-1结合,可介导NO释放。然而PLGF与Flt-1结合对NO生成影响少有报道。 基于以上背景,我们从组织和细胞水平上开展一些实验研究:首先在组织水平上用免疫组织化学方法、免疫印迹方法、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、硝酸还原酶法检测PLGF、Flt-1受体、NO在胎盘中的表达;分析PLGF、Flt-1与HDCP发病及NO之间关系。然后在细胞水平上研究PLGF-1对血管生成和NO释放的影响,我们使用PLGF-1刺激原代培养脐静脉内皮细胞(HUVEC),用MTT法和硝酸还原酶法观察PLGF-1对HUVEC增殖及NO释放的影响;并进一步探讨PLGF-1对HUVEC增殖和NO释放作用的分子机制。通过以上研究将有助于深入探讨HDCP发生机制,并为该病的防治提供理论依据。 1.胎盘生长因子与HDCP发病及NO关系的研究 选择HDCP患者46例,其中子痫前期重度23例,子痫前期轻度1 1例,妊娠期高血压10例,子痫1例,慢性高血压并发子痫前期1例,选择同期正常妊娠妇女20例作为对照组。采用免疫组织化学染色法、免疫印迹法和RT-PCR方法检测两组患者胎盘PLGF、Flt-1蛋白及mRNA表达。采用硝酸还原酶法测定两组胎盘组织NO浓度变化。 结果显示:(1)PLGF及Flt-1在HDCP组及对照组胎盘中分布范围基本一致,主要分布在绒毛合体滋养细胞、绒毛血管内皮细胞和间质细胞的胞浆,Flt-1在血管平滑肌细胞中也有表达。(2)HDCP组子痫前期轻、重度胎盘绒毛PLGF、Flt-1受体蛋白表达均显著低于对照组,差异有统计学意义(p0.05),妊娠期高血压组与对照组相比,差异无统计学意义。(3)子痫前期轻、重度胎盘组织PLGFmRNA平均灰度分别为(3.33±0.39),(1.97±0.29),显著低于对照组PLGFmRNA平均灰度(4.87±0.60)(p0.01);而子痫前期轻、重度胎盘组织Flt-1mRNA平均灰度分别为(2.14±0.42),(2.81±0.39),高于对照组平均灰度(1.55±0.49),差异有统计学意义(p0.05)。妊娠期高血压组胎盘组织PLGFmRNA、Flt-1mRNA与对照组相比,差异无统计学意义。(4)子痫前期轻、重度胎盘组织中NO浓度分别为(8.20±5.56)μmol/g,(6.46±2.25)u mol/g,显著低于对照组(18.10±7.12)μmol/g,(p0.05);妊娠期高血压组胎盘组织NO浓度与对照组差异无显著性。(5)HDCP组胎盘组织PLGF蛋白表达水平与胎盘组织NO浓度呈显著正相关(r=0.54,p0.05)。 2.PLGF-1对原代培养人脐静脉内皮细胞增殖及NO释放的影响 选择正常晚孕剖宫产儿脐带,分离脐静脉内皮细胞,进行原代培养。采用细胞形态学观察和内皮细胞特异性抗原Ⅷ因子免疫组织化学法鉴定分离培养的细胞。然后采用免疫印迹方法、RT-PCR方法测定HUVEC中Flt-1的表达;利用噻唑盐比色法(MTT)检测PLGF-1对HUVEC增殖的影响。将细胞用PLGF-1或PLGF-1+ERK特异性抑制剂PD98059分别处理,在不同时间点上收集细胞或收集细胞培养液,然后采用免疫印迹方法检测ERK蛋白的激活情况,用硝酸盐还原酶法测细胞培养液上清中NO水平。 结果显示:(1)细胞形态学观察和Ⅷ因子免疫组织化学鉴定培养的细胞为HUVEC。(2)Flt-1基因和蛋白在HUVEC中有表达。(3)MTT法显示PLGF-1可显著刺激HUVEC增殖,并呈剂量依赖关系,与对照组比较,差异有统计学意义(p0.05)。(4)PLGF—1可显著诱导HUVEC释放N0,并呈剂量依赖关系;预先用PD98059处理细胞后再用PLGF-1刺激,NO释放较单用PLGF-1组比较受到抑制。 (5)PLGF-1对HUVEC中磷酸化ERK-1/2有激活作用。 综上所述,我们通过实验研究获得如下成果: 1.HDCP组子痫前期轻、重度胎盘组织中PLGF蛋白、mRNA低水平表达,提示HDCP患者可能由于胎盘缺血缺氧,使滋养细胞形态和功能发生改变,其中可引起PLGF分泌下调,而低下的PLGF水平又会影响到HDCP患者绒毛外滋养细胞增殖浸润能力,影响到HDCP患者胎盘血管网络形成,使胎盘缺氧进一步发展。 PLGF特异性结合的受体F1t-1蛋白在HDCP组子痫前期轻、重度胎盘组织中低表达,而Flt-1 mRNA高表达,提示尽管该受体在HDCP患者绒毛组织中转录水平增加,但可能转录以下水平,即蛋白质翻译和翻译后水平发生障碍,影响受体功能的发挥。HDCP患者胎盘组织PLGF、Flt-1表达降低,共同影响了PLGF生物学功能的发挥,引发和促进了HDCP发生发展。 2.HDCP组胎盘组织NO浓度与对照组相比显著降低;HDCP组胎盘组织PLGF蛋白水平与胎盘组织NO浓度呈正相关关系,认为HDCP组患者胎盘中PLGF的减少除了引起滋养细胞增殖和浸润减弱外,还可能通过影响NO含量的多少,进一步导致胎盘缺血缺氧,在HDCP发病中起重要作用。 3.PLGF—1显著刺激HUVEC细胞增殖和诱导NO释放;PLGF-1对HUVEC中磷酸化ERK-1/2有激活作用;ERK特异性抑制剂可减少PLGF-1介导的HUVEC释放NO。这些结果提示PLGF-1结合Flt-1受体后,可能通过激活ERK-MAPK有丝分裂原信号转导途径刺激HUVEC增殖;同时ERK—MAPK信号通路可能也是PLGF诱导HUVEC释放NO的分子机制之一。 我们观察和分析了PLGF、Flt-1受体和NO在HDCP中的作用及其有关作用机制,为探讨HDCP的发病提供了新的实验和理论依据。


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