丙泊酚对大鼠空间学习记忆能力影响的实验研究

【摘要】： 第一部分丙泊酚对大鼠空间学习记忆能力的影响 目的:利用Morris水迷宫,研究不同剂量的丙泊酚对于大鼠空间学习记忆能力的影响。 方法:24只SD大鼠随机分为4组,每组6只。Pr010组、Pr030组和Pr075组,分别给予丙泊酚10、30和75mg/kg腹腔注射;Intra组给予与Pr075组等体积的脂肪乳腹腔注射作为溶剂对照。Pro10组、Pr030组和Intra组大鼠在训练前20min接受上述药物腹腔注射;Pr075组大鼠则在翻正反射恢复后20min进行训练。第1～5天进行定位导航实验。大鼠每天训练一次,每次训练前给予上述药物。把大鼠从离平台最远的象限,在固定的入水点把大鼠背对平台投入水中,计时180s。若大鼠找到平台,让其在平台上停留30s,若未能找到平台,引导其找到平台,同样停留30s。记录大鼠寻找平台的时间,即潜伏期(若在规定时间内未找到平台,按照180s计算),记录寻找平台的路径长度和游泳速度。第6天不给予任何药物进行附加实验,入水点改为平台所在象限的毗邻左侧象限,观察和记录方法同前。第7天不给予任何药物测定大鼠的空间探索能力,撤去水中的平台,入水点与第1～5天训练时的位置相同。记录60s内停留在原平台所在象限的时间。 结果:(1)定位航行实验,大鼠寻找平台的潜伏期,Pr075组明显较Intra组、Pro10组和Pr030组长(P0.01)。其中第3、4、5天Pr075组的潜伏期明显较Intra组长(P0.01)。大鼠寻找平台的路径,Pro75组明显较Intra组、Pr010组和Pr030组长(P0.01)。第3、4、5天Pr075组大鼠寻找平台的路径较Intra组更长(P0.01)。各组大鼠寻找平台的游泳速度没有差异(P0.05)。附加实验,Pr030组和Pr075组大鼠寻找平台的潜伏去明显长于Intra组(P0.01)。Pr075组大鼠寻找平台的潜伏去明显长于Intra组、Pro10组和Pr030组(P0.01)。各组大鼠寻找平台游泳的速度没有差异(P0.05)。(2)空间探索实验,Intra组、Pr010组、Pr030组和Pr075组大鼠在第Ⅲ象限(原来平台所在象限)停留时间分别为25.2±6.6s、22.0±1.3s、20.0±6.9s和15.0±3.8s,Pr075组大鼠在第Ⅲ象限停留时间明显短于Intra组(P0.01)和Pro10组(P0.05)。 结论:多次给大鼠腹腔注射丙泊酚实施麻醉可以损害其空间学习记忆能力。 第二部分丙泊酚对大鼠海马脑片CA1区长时程增强的影响及其机制 实验一不同浓度的丙泊酚对大鼠海马脑片CA1区长时程增强的影响 目的:以离体海马脑片作为实验材料,利用细胞外记录技术,观察不同浓度丙泊酚对于离体海马脑片CA1区长时程增强(LTP)的影响。 方法:制备大鼠海马脑片,并用人工脑脊液孵育。将制备的脑片随机分为6组,每组6张脑片:Pr0100组、Pr030组、Pro10组和Pr03组分别应用终浓度为100、30、10和3μmol/L的丙泊酚,Intra组应用脂肪乳作为溶剂对照,Control组不加任何药物作为空白对照。应用上述药物预先孵育脑片60min后,再进行细胞外诱发电位的记录。用引起群峰电位(PS)最大反应50%的强度作为测试刺激,待PS稳定后,记录PS 20min,取其平均值作为基准值。然后施以100Hz、400个脉冲、波宽0.15ms的高频刺激(HFS),此后继续用测试刺激诱发PS并加以记录。 结果:Control组、Intra组和Pr03组实施HFS后,PS明显升高,HFS后40min的PS分别为1.501±0.124、1.436±0.160和1.332±0.077,高于基础值(P0.01或P0.05)。Pro10组、Pr030组和Pr0100组实施高频刺激后,其PS未明显增高,HFS后40min其PS分别为1.118±0.072、1.031±0.112和0.981±0.047,与基础值相比没有差异(P0.05)。HFS后40min时,Pr03组PS与Control组和Intra组相比没有差异(P0.05)。HFS后40min时,Pro10组PS则显著低于Control组和Intra组(P0.01)和Pr03组(P0.05)。HFS后40min时,Pr030组PS也显著低于Control组、Intra组、Pr03组(P0.01)以及Prol0组(P0.05)。HFS后40min时,Pr0100组PS也显著低于Control组、Intra组、Pr03组和Pr010组(P0.01);与Pr030组相比无显著差异(P0.05)。 结论:丙泊酚可以抑制大鼠海马脑片CAl区LTP的形成。 实验二丙泊酚抑制大鼠海马脑片CAl区长时程增强的机制 目的:以离体海马脑片作为实验材料,采用细胞外记录技术,观察γ-氨基丁酸(GABA)A受体在丙泊酚对大鼠海马脑片CA1区LTP抑制中的作用。 方法:将制备的脑片随机分为4组,每组6张脑片:AP-5组应用终浓度为50μmol/L的AP-5;Pr030组应用终浓度为30μmol/L的丙泊酚;Pr030+PTX组应用终浓度为30gmol/L的丙泊酚和50gmol/L的印防己毒素;Intra组应用脂肪乳作为溶剂对照。应用上述药物预先孵育脑片60min后,再进行细胞外诱发电位的记录。用引起PS最大反应50%的强度作为测试刺激,待PS稳定后,记录PS20min,取其平均值作为基准值。然后施以高频刺激(HFS),此后继续用测试刺激诱发PS并加以记录。 结果:Intra组实施HFS后PS升高,HFS后40min时的PS为1.436±0.160,显著高于实施高频刺激前(P0.01)。AP-5组实施HFS后40min时的PS为1.001±0.089,与实施HFS前的PS相比没有差异(P0.05),但是明显低于Intra组(P0.01)。Pr030组实施HFS后PS未见升高,HFS后40min时的PS为1.031±0.112,与高频刺激前比较没有差异(P0.05),但是明显低于Intra组(P0.01)。Pr030+PTX组实施HFS后PS升高,HFS后40min时,Pr030+PTX组的群峰电位明显高于Pr030组(P0.01),但与Intra组相比没有差异(P0.05)。 结论:GABAA受体参与了丙泊酚对于大鼠海马脑片CA1区LTP的抑制。 实验三丙泊酚复合皮质酮对大鼠海马脑片CA1区长时程增强的影响 目的:以离体海马脑片作为实验材料,采用细胞外记录技术,观察不同浓度的皮质酮复合应用丙泊酚对于海马脑片CA1区LTP的影响。 方法:将制备的脑片随机分为7组,每组6张,各组应用下列终浓度的药物:Pro3组应用3μmol/L丙泊酚,Cort0.1组应用0.1μmol/L皮质酮,Con10组应用10μmol/L皮质酮,Pro3+Cort0.1组复合应用3μmol/L丙泊酚和0.1μmol/L皮质酮,Pro3+Cort10组复合应用3μmol/L丙泊酚和10μmol/L皮质酮,脂肪乳组加入脂肪乳作为溶剂对照,对照组不加入上述任何药物。应用上述药物预先孵育脑片60min后,再进行细胞外诱发电位的记录。调整刺激器使刺激强度达到诱发最大PS的50%为宜用,待PS稳定后,记录PS20min,取其平均值作为基准值。然后施以高频刺激(HFS),此后继续用测试刺激诱发PS并加以记录。 结果:Control组和Intra组实施HFS后,PS明显升高,HFS后40min的PS分别为1.501±0.124和1.436±0.160,明显高于基础值(P0.01)。Pro3组、Con0.1组和Pro3+Cort0.1组实施高频刺激后PS升高,HFS后40min时PS分别为1.332±0.077、1.385±0.095和1.342±0.031,明显高于基础值(P0.05),但是与Intra组相比没有显著差异(P0.05)。Cort10组、Pro3+Cort10组实施HFS后PS未见明显升高,HFS后40min时群峰电位分别为1.180±0.089和0.989±0.030,与其基础值相比无差异(P0.05),但是低于InCa组和Pro3组(P0.05),并且Pro3+Cort10组PS明显低于Con10组和Pro3+Cort0.1组(P0.05)。 结论:低浓度丙泊酚(3μgmol/L)抑制大鼠海马脑片CA1区LTP,而低浓度丙泊酚(31μmol/L)复合高浓度皮质酮(10μmol/L)可以抑制大鼠海马脑片CA1区LTP,并且其抑制作用较单独应用高浓度皮质酮(10μmol/L)更强。 第三部分丙泊酚对大鼠海马突触体释放谷氨酸和γ-氨基丁酸的影响 实验一丙泊酚对大鼠海马突触体Ca2+依赖性和非Ca2+依赖性释放谷氨酸和γ-氨基丁酸的影响 目的:利用大鼠海马突触体模型,观察丙泊酚对其谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的Ca2+依赖性释放和非Ca2+依赖性释放的影响。 方法:应用SD大鼠,制备海马突触体,用人工脑脊液孵育(aCSF)。把突触体随机分为7组,分别加入不同浓度的丙泊酚,使其终浓度分别为3、10、30、100、300μmol/L,依次为Pro3组、Pro10组、Pro30组、Pro100组、Pro300组,溶剂对照组(Intra组)加入脂肪乳,空白对照组(Control组)不加入上述药物。在37℃条件下水浴15-20min后加入20μmol/L藜芦定或30mmol/L KCl诱发递质释放。5min后,迅速加入终浓度为10mmol/L乙二醇双(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA),并迅速放入冰水浴中,然后12000×g离心20min,收集上清液,存放在-70℃低温冰箱待测。观察Ca2+依赖性释放时,向aCSF中加入哌啶酸(GABA转运体抑制剂)和DHK(谷氨酸转运体抑制剂);观察非Ca2+依赖性释放时,aCSF中不加入哌啶酸和DHK和Ca2+。观察30mmol/L KCl诱发递质释放时,应用NaCl浓度为98.9 mmol/L的aCSF。应用反相高效液相色谱法测定各突触体反应液中谷氨酸和GABA的浓度。 结果:10、30、100和300μmol/L的丙泊酚可以抑制黎芦定诱发的Ca2+依赖性谷氨酸释放。Pro30、Pro100和Pr0300组的谷氨酸释放量均明显低于Pro3组(P0.01);Pro100和Pro300组的谷氨酸释放量均明显低于Pro10组(P0.01);Pro300组的谷氨酸释放量低于Pro30组(P0.05)。丙泊酚抑制谷氨酸释放的IC50为17.2μmol/L。30、100和300μmol/L的丙泊酚可以抑制黎芦定诱发的Ca2+依赖性GABA释放,Pro30、Pro100和Pr0300组的GABA释放量均明显低于Pr03组(P0.01)和低于Pro10组(P0.05或P0.01)。丙泊酚抑制GABA释放的IC50为20.1μmol/L。应用KCl诱发突触体Ca2+依赖性释放谷氨酸和GABA,其释放量无差异(P0.05)。应用藜芦定和KCl诱发非Ca2+依赖性谷氨酸和GABA,其释放量无差异(P0.05)。 结论:丙泊酚可以抑制黎芦定诱发突触体Ca2+依赖性释放谷氨酸和GABA;而对高浓度KCl诱发的Ca2+依赖性释放谷氨酸和GABA。丙泊酚不影响黎芦定和KCl诱发的非Ca2+依赖性释放谷氨酸和GABA。 实验二突触前膜GABAA受体在丙泊酚抑制谷氨酸和γ-氨基丁酸 Ca2+依赖性释放中的作用 目的:利用大鼠海马突触体模型,探讨突触前膜GABAA受体在丙泊酚抑制谷氨酸和GABA的Ca2+依赖性释放中的作用。 方法:制备大鼠海马突触体,随机分为5组:PTX组加入印防己毒素(PTX)使其终浓度为50μmol/L,Pro30+PTX组加入终浓度为30μmol/L的丙泊酚和50μmol/L的PTX,Pro30组加入终浓度为30μmol/L的丙泊酚,溶剂对照组(Intra组)加入脂肪乳,空白对照组(Control组)不加入上述药物。诱发谷氨酸和GABACa2+依赖性释放的方法步骤同第三部分实验一。应用反相高效液相色谱法测定各突触体反应液中谷氨酸和GABA的浓度。 结果:Pro30组突触体释放的谷氨酸和GABA量少于Intra组(P0.0 1)。PTX组突触体谷氨酸和GABA的释放量与Intra组相比没有差异(P0.05)。Pro30+PTX组突触体释放谷氨酸和GABA的量与Pro30组相似(P0.05),明显低于Intra组(P0.01)。 结论:丙泊酚抑制黎芦定诱发突触体Ca2+依赖性释放谷氨酸和GABA,但这一作用不是通过GABAA受体实现的。