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美满霉素对多巴胺能神经元保护机制的实验研究

沈伟  
【摘要】: 第一部分美满霉素抑制脂多糖诱导的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶的表达 目的在离体细胞培养中,探讨美满霉素(Minocycline,MC)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的BV-2细胞一氧化氮(nitric oxide,NO)产生及诱导型一氧化氮合酶(Induced nitricoxide synthase,iNOS)表达的影响。方法将MC或LPS加入培养的BV-2细胞中,使用酶法测定培养上清中的NO的浓度,免疫组织化学方法观察BV-2细胞中iNOS蛋白的表达,逆转录聚合酶链式反应检测细胞iNOS mRNA表达。结果LPS(100ng/ml)组BV-2细胞培养上清中的NO含量显著升高(P<0.05),iNOS蛋白和mRNA的表达也显著升高(均P<0.01),高于空白对照组。MC(10μmol/L)预处理可明显抑制上述变化。MC+LPS组BV-2细胞培养上清中NO含量,细胞中iNOS蛋白、mRNA的表达较LPS组显著下降(均P<0.01),但仍显著高于空白对照组(均P<0.05)。结论MC预处理可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞iNOS的表达及NO产生。 第二部分美满霉素抑制脂多糖诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子-α的表达 目的在离体细胞培养中,探讨MC对LPS诱导的BV-2细胞肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响。方法将MC或LPS加入培养的BV-2细胞中,使用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫组织化学方法观察BV-2细胞中TNF-α蛋白的表达,逆转录聚合酶链式反应检测细胞TNF-αmRNA表达。结果LPS(100ng/ml)组BV-2细胞培养上清中的TNF-α含量显著升高(P<0.01)、细胞中TNF-α蛋白和mRNA的表达也显著升高(均P<0.01),高于空白对照组。MC(10μmol/L)预处理可明显抑制上述变化。MC+LPS组BV-2细胞培养上清中TNF-α含量较LPS组显著下降(P<0.01),与空白对照组比较无差异(P>0.05)。MC+LPS组BV-2细胞中TNF-α蛋白、mRNA的表达较LPS组显著下降(均P<0.01),但仍显著高于空白对照组(均P<0.05)。结论MC预处理可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞TNF-α的表达。 第三部分美满霉素下调P38MAPK的表达抑制脂多糖诱导的小胶质细胞的活化 目的在离体细胞培养中,探讨MC抑制LPS诱导的BV-2细胞活化与P38MAPK信号传导途径的关系。方法将MC或LPS加入培养的BV-2细胞中,利用Western免疫印迹法观察BV2细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)表达的变化。结果实验各组BV-2细胞P38MAPK总蛋白水平无变化;空白对照组、MC组几乎无磷酸化P38MAPK(P-PMAPK)蛋白的表达;LPS组P-PMAPK蛋白表达水平显著上调,与空白对照组有显著差异(P<0.01);MC+LPS组BV-2细胞中P-PMAPK蛋白表达水平较LPS组显著下降(P<0.01),但仍显著高于空白对照组(均P<0.01)。结论MC可能通过下调P38MAPK信号途径的活性抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活。 第四部分美满霉素对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用 目的在离体细胞培养中,探讨MC对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)诱导的帕金森病细胞凋亡模型的保护作用并探讨其机制。方法将MC或MPP~+加入培养的PC12细胞中,建立多巴胺神经元凋亡模型,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞代谢活性,电泳法检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链式反应分别检测细胞Caspase-3 mRNA表达。结果MPP~+浓度为10μmol/L时,建立多巴胺神经元凋亡模型。MC100μmol/L预处理可明显升高MPP~+处理的PC12细胞的细胞活性。MC+MPP~+处理组细胞凋亡率显著低于MPP~+处理组(P<0.01),但仍明显高于空白对照组(P<0.05)。MC+MPP~+组细胞Caspase-3 mRNA表达明显低于MPP~+组(P<0.01),仍明显高于空白对照组(P<0.05)。结论MC对MPP~+诱导的细胞凋亡有一定的保护作用,MC可能通过下调Caspase-3 mRNA表达保护MPP~+诱导的细胞凋亡。


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