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MAPK家族在机械通气相关性肺损伤中作用机制的研究

王月兰  
【摘要】: 第一部分机械通气相关性肺损伤模型的建立 目的复制大鼠在体机械通气相关性肺损伤(VILI)模型,探讨机械通气诱发肺损伤的病理生理变化和可能机制。 方法48只健康雄性SD大鼠采用3%戊巴比妥35-40mg/kg腹腔注射麻醉后行气管切开并置入气管导管固定,将之随机分为三组(n=16):对照组(C组):麻醉后仅做气管切开不做机械通气;低潮气量机械通气组(LV):潮气量(Vt):6ml/kg,余同高潮气量组;高潮气量机械通气组(HV):Vt:42ml/kg,呼吸频率(RR):40次/min,吸呼比(I:E):1:2,呼气末正压通气压力(PEEP)为0,吸入氧浓度:21%,机械通气4h。实验结束后分别测定各组大鼠的动脉血气、肺组织湿/干重比(W/D)、肺通透指数(LPI):支气管泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量/血清蛋白比值、BALF中炎性细胞计数与分类;采用ELISA方法测定肺组织、BALF和血浆中TNF-α和MIP-2水平,并在光学显微镜和电子显微镜下观察肺组织病理及超微结构的改变。 结果(1)动脉血气的变化实验前三组大鼠动脉血pH值、PaCO_2和PaO_2差异无统计学意义,C组各时间点上述参数的变化无统计学意义(P>0.05);与基础值比较,LV组PaO_2于1h时升高,4h时PaCO_2升高(P<0.05);HV组1h时动脉血pH值、PaO_2升高,PaCO_2降低(P<0.05),4h时pH值、PaO_2降低,PaCO_2升高(P<0.05)。(2)与C组、LV组比较,机械通气4h时HV组大鼠LPI、W/D增加(P<0.01);C和LV组间二者的变化无统计学差异(P>0.05);与C、LV组比较,HV组BALF中总有形核细胞数增多,中性粒细胞百分比增高,肺损伤评分升高(P<0.01);LV组BALF中总有形核细胞数略增加,但细胞分类、肺损伤评分与C组比较,无显著性差异(P>0.05)。(4)与C、LV组比较,HV组于机械通气4h时大鼠肺组织、BALF、血浆TNF-α和MIP-2水平升高(P<0.01),且肺组织、BALF二者的水平高于血浆中含量(P<0.05);LV组肺组织、BALF中TNF-α和MIP-2水平高于C组,而血浆中二者的含量与C组比较,无显著性变化(P>0.05)。(5)光学显微镜下见C组肺泡腔清晰、肺泡及其间质无水肿、炎症等特殊改变;LV组肺泡腔内略有少量炎性细胞,余同C组;HV组肺组织结构破坏,肺泡腔、血管旁和支气管周围有大量炎性细胞以巨噬细胞和淋巴细胞居多,其次中性粒细胞;肺泡间隔增厚,肺泡腔内大量渗出物和透明膜形成,肺间质出血和水肿。(6)电子显微镜下见C组肺上皮细胞结构完整、肺泡壁和血气屏障连续、无水肿;LV组肺泡腔内见少量巨噬细胞,肺泡壁略增厚,余同C组;HV组肺上皮Ⅰ、Ⅱ型细胞严重破坏、肺泡壁水肿、基底膜破损间断、肺泡—毛细血管屏障断裂不连续;肺泡腔内可见大量异形红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。 结论高潮气量机械通气4h可复制典型的机械通气相关性肺损伤的在体模型;由机械通气诱发的肺损伤不但是一种机械性损伤而且合并炎性反应性损伤。 第二部分过度机械通气对肺组织早期反应基因表达的影响 目的观察过度机械通气不同时点对大鼠肺组织早期生长因子(Egr-1)、C-jun和白介素-1β(IL-1β)基因和蛋白表达的变化及肺损伤程度的影响,以探讨过度机械通气诱发的肺内早期基因表达变化和肺损伤关系。 方法选择清洁级雄性SD大鼠40只,随机分为对照组(A组)和机械通气30、60、90、120min组(B、C、D、E组),每组8只。所有动物均腹腔注射3%戊巴比妥35mg/kg麻醉后行气管切丌置管,通气组以Vt 42 ml/kg,RR40次/min,I:E为1:2,PEEP=0,FIO_2为21%,进行机械通气;A组气管切开置管不做机械通气。实验结束后放血处死大鼠,测各时间点动脉血气,并分别以RT-PCR、免疫组化和HE染色方法测肺组织Egr-1、C-jun和IL-1β的mRNA和蛋白表达及光学显微镜下观察肺组织病理学变化。 结果五组大鼠PaO_2和SaO_2的变化无统计学意义;与A组比较,B、C组动脉血pH值升高、PaCO_2降低(P<0.05),D、E组各参数差异无统计学意义(P>0.05);与B、C比较,E组动脉血pH值降低,PaCO_2升高、PaO_2、SaO_2均降低(P<0.05)。与A组比较,B组Egr-1、C-jun、IL-1βmRNA和蛋白表达的变化无统计学意义(P>0.05);C组Egr-1、C-jun mRNA和蛋白表达增加,D、E组Egr-1、C-jun、IL-1βmRNA和蛋白表达均增加(P<0.05)。与B、C组比较,D、E组上述三种基因、蛋白表达均增加(P<0.05或0.01),且E组高于D组(P<0.05)。肺组织病理学改变光镜下发现A、B组肺泡结构未见异常,C组肺泡腔内略有渗出、血管周围炎症细胞少量;D组肺泡壁略增厚、出血、肺泡腔内渗出物和巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞等略增多,为轻度肺损伤;E组病理改变加重,为中度肺损伤。 结论过度机械通气在肺损伤未发生时即可激活和上调肺组织中Egr-1、IL-β和C-jun的表达,且随肺损伤的加重而表达量增加,这些基因表达的变化有可能成为肺损伤早期的表现或正是由于这些基因的激活而启动VILI的开始,即可能与机械通气诱发肺损伤的机制有关。 第三部分MAPK在机械通气相关性肺损伤中的作用 目的观察VILI过程中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性变化以及对肺损伤的影响,探讨MAPK在VILI中的作用和机制。 方法72只SD大鼠随机分为未处理的对照组(C组,不行机械通气)、低潮气量通气组(LV组)、高潮气量通气组(HV)和采用JNK拮抗剂预处理的SP600125+C组、SP600125+LV组、SP600125+HV组;采用p38拮抗剂预处理的SB203580+C组、SB203580+LV组、SB203580+HV组及ERK拮抗剂预处理的PD98059+C组、PD98059+LV组、PD98059+HV组,共12组,每组6只大鼠。机械通气4h后取大鼠肺组织采用Western blot方法测定各组肺组织中总JNK、ERK、p-38蛋白激酶的表达及其磷酸化水平。同时以ELISA方法测定大鼠肺组织、BALF和血浆中的肿瘤坏死因子-α(TNF—α)、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)浓度;并测定W/D、LPI、BALF中炎性细胞数量及观察肺组织病理变化。 结果(1)各组大鼠肺组织中总JNK、p38、ERK1/2蛋白表达无显著差异(P>0.05)。与C、LV组比较,HV组JNK、p38、ERK1/2的磷酸化水平显著升高(P<0.01);与C组比较,LV组JNK、ERK磷酸化水平升高;与LV和HV组比较,JNK、ERK、p38特异拮抗剂预处理的LV和HV组JNK、p38、ERK1/2的磷酸化水平显著降低(P<0.05或0.01)。(2)HV组大鼠肺组织、BALF、血浆中的TNF-α、MIP-2水平显著高于其它组(P<0.01)。JNK、ERK、p38拮抗剂预处理的HV组肺组织、BALF中的TNF-α、MIP-2水平较未处理HV组降低(P<0.05或0.01)。(3)MAPK拮抗剂处理HV组,大鼠肺组织中W/D、LPI比值较未处理的HV组降低,其在BALF中的炎性细胞总数和中性粒细胞百分比也显著减少(P<0.05或0.01)。(4)组织病理学观察发现MAPK拮抗剂预处理的HV组肺水肿、肺出血及渗出较未处理HV组减轻;肺内炎性细胞浸润减少。 结论低、高潮气量机械通气均可不同程度地激活肺组织细胞中的JNK、ERK、p38激酶,且JNK、ERK、p38激酶参与了机械通气诱发肺损伤的形成,即MAPK信号转导通路的激活可能是VILI发生机制之一。 第四部分MAPK在机械通气过程中对NF-κB活性与表达的影响 目的观察MAPK及其特异拮抗剂在VILI过程中对NF-κB活性和表达的影响 方法动物分组方法及其MAPK拮抗剂应用同第三部分,即将健康成年SD大鼠72只随机分为对照组(C组)、低潮气量通气组(LV组)、过度通气组(HV组)、以及三种MAPK拮抗剂SP600125、PD98059、SB203580分别处理上述三组,共12组,每组6只大鼠。机械通气4h后,自动脉放血处死后,取肺组织以Western blot方法检测NF-κB p65蛋白表达水平;免疫组化法测定Ⅰ-κBβ和NF-κ3在肺内表达与分布;凝胶电泳迁移率实验测定NF-κB的DNA结合活性。 结果(1)与C组比较,LV、HV组大鼠肺组织中的NF-κB p65增加,分别为C组的2.34、4.89倍;且HV组其含量高于LV组(P<0.05)。而SP600125、PD98059和SB203580预处理后的C组和LV组NF-κB p65蛋白含量变化与未处理时比较,无统计学差异(P>0.05);与HV组比较,SP600125+HV组、PD98058+HV组、SB203580+HV组NF-κB p65表达量分别减少49%、36%和减少25.8%(P<0.05)。(2)EMSA测定结果:与C组比较,LV、HV组大鼠肺组织NF-κB的DNA结合活性增强分别为C组的2.31、4.76倍(P<0.01);与HV组比较,SP600125+HV组、PD98059+HV组、SB203580+HV组NF-κB活性分别降低55.9%、43.0%和21.6%(P<0.05)。(3)免疫组化结果显示:Ⅰ-κBβ和NF-κB均可在肺组织的巨噬细胞、中性粒细胞和肺、支气管上皮细胞胞浆或胞核内表达;Ⅰ-κBβ表达量随潮气量的增大而减少;而NF-κB的改变与之相反,且由细胞浆表达逐渐增加为胞核表达为主。三种MAPK拮抗剂可以抑制Ⅰ-κBβ表达的减少、抑制NF-κB的核转移并减少其在细胞浆、核内表达量。 结论NF-κB在机械通气过程中被激活;MAPK抑制剂可以部分抑制NF-κB核转移,这种现象可能是通过抑制Ⅰ-κBβ磷酸化,减少其降解有关。机械通气诱发肺损伤可能是通过MAPK的激活,进一步直接或间接激活NF-κB所致。 第五部分MAPK在机械通气过程中对肺上皮细胞特异蛋白基因表达的影响 目的探讨MAPK在机械通气过程中对肺上皮细胞特异蛋白基因表达的影响。 方法将健康成年SD大鼠36只随机分为对照组(C组)、低潮气量通气组(LV组)、高潮气量通气组(HV组)、SP600125+HV组、PD98059+HV组、SB203580+HV组,共6组,每组6只大鼠,各种拮抗剂的使用方法同第三部分。各组呼吸参数见第一部分。采用RT-PCR方法测定各组肺组织中肺Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞特异蛋白RTI40、SP-A、B和C基因表达的变化。 结果(1)与C组比较,LV组SP-A、B、C和RTI40基因表达差异无统计学意义(P>0.05),HV组SP-A、SP-C表达降低,TRI40表达增加(P<0.05或<0.01),SP600125+HV组、SB203580+HV组SP-A、C基因表达减少(P<0.05),PD98059+HV组SP-A、B和C表达变化差异不显著(P>0.05)。与HV组比较,SP600125+HV组、PD98059+HV组、SB203580+HV组肺组织中SP-A、C基因表达量增加(P<0.05或<0.01),RTI40基因表达降低(P<0.05),SP-B无显著变化。与PD98059+HV组比较,SP600125+HV组、SB203580+HV组SP-A、C基因表达量降低(P<0.05),三组间SP-B和TRI40基因表达变化无统计学差异(P>0.05)。 结论机械通气可致肺上皮细胞特异蛋白SP-A、C基因表达下降和RTI40基因表达上调,而MAPK拮抗剂可部分地防止该现象发生;提示VILI过程中肺Ⅰ、Ⅱ上皮细胞分泌肺表面活性物质功能受到抑制或障碍,而MAPK参与了VILI过程中肺上皮细胞分泌功能的影响。 第六部分周期牵张A549细胞致IL-8表达增加机制 目的探讨周期牵张离体肺腺癌A549细胞致白介素-8(IL-8)分泌增加的机制及JNK在此过程中的作用。 方法雪将A549细胞以密度为5×10~5种植于特制的硅胶树脂膜上,于细胞培养箱内培养48h后,置于细胞牵张仪行周期性牵张。对照组:牵张强度为细胞体积扩大15%、牵张周期:30个周期/min、牵张时间分别为0、15、30、60、120 min 5个时间点。预处理组:将JNK抑制剂SP600125按照50μmol/L加入培养基,孵育30min后再行上述处理。收集每个时间点3次试验后的细胞和培养培养基上清液,提取细胞中的总蛋白和RNA,采用ELISA测定细胞培养液中的IL-8含量;以RT—PCR方法测定细胞中IL-8mRNA的表达;Western blot测定细胞中JNK和磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达和活性。 结果与细胞牵张0、15min时点比较,30min时对照组细胞IL-8基因、蛋白表达增加,且随时间延长而增加,120min时达高峰(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较,于细胞牵张30、60、120min时,预处理组IL-8基因和蛋白表达均降低(P<0.05);预处理组各时点细胞中IL-8的含量和基因表达无统计学差异(P>0.05)。总JNK蛋白表达各组间无统计学差异(P>0.05);与0、15min时点比较,对照组p-JNK水平于30、60、120 min时点升高,且于15、30、60、120min时点,其磷酸化水平高于预处理组(P<0.01)。 结论JNK参与了周期牵张A549细胞所致的IL-8分泌增加。JNK的激活可能为机械牵张导致肺细胞生物学损伤的机制之一。


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